- •Лабораторна робота 1 Глибинне культивування Asp. Niger з метою одержання лимонної кислоти
- •Перше заняття
- •1. Готування посівного й ферментаційного середовищ
- •2. Визначення рН посівного й ферментаційного середовищ і доведення до рН 7,0
- •3. Визначення сухих речовин методом рефрактометрії
- •4. Визначення вмісту цукру за методом Бертрана
- •Друге заняття
- •1.Визначення біомаси
- •2. Визначення рН середовища
- •3. Визначення загальної кислотності
- •4. Визначення вмісту цукру в культуральній рідини по Бертрану
- •5. Визначення лимонної, щавлевої й глюконової кислот й їхній розрахунок
- •Лабораторна робота 2 Культивування цвілевого гриба Asp. Niger поверхневим способом з метою одержання лимонної кислоти
- •Перше заняття
- •1. Підготовка посуду для стерилізації
- •2. Готування живильного й з її стерилізація
- •3. Визначення концентрації сухих речовин у вихідному середовищі
- •4. Визначення рН середовища
- •6. Засівання стерильного середовища спорами продуцента, характеристика умов культивування
- •Друге заняття
- •2. Визначення в збродженому розчині загальної титруємої кислотності й знімання кислоти г/м2 за добу
- •3. Визначення лимонної, щавлевої й глюконової кислот й їхній розрахунок
- •3.2. Визначення щавлевої кислоти
- •4. Визначення сухої ваги міцелію й розрахунок його продукуючої здатності по лимонній кислоті
- •5. Визначення в середовищі залишкового цукру
- •6. Розрахунок кількості спожитого цукру
- •7. Розрахунок виходу лимонної кислоти від спожитого цукру
- •Додатки
- •Застосування органічних кислот
4. Визначення сухої ваги міцелію й розрахунок його продукуючої здатності по лимонній кислоті
Плівку гриба, що залишилася в склянці, не порушуючи її цілісності, переносять на більшу лійку Бюхнера, де на дно покладений фільтр. Зверху плівку прикривають 2 – 3 круглими фільтрами й, надавлюючи зверху дном склянки, підсушують під вакуумом протягом 15 – 20 хв , потім плівку поміщають у великий підсушений до постійної маси подвійний пакет і висушують у приладі Чижової протягом 7 – 8 хв при температурі 170 – 175°С.
Після висушування пакет із плівкою поміщають в ексикатор через 3 – 4 хв зважують на технічних терезах. За різницею підраховують масу сухої біомаси міцелію (Бм) і потім його продукуючу здатність (Пзд).
Приклад розрахунку.
Маса сухого пакета – 5,04 р.
Маса сухого пакета із сухим міцелієм – 8,32 р.
Маса сухої біомаси міцелію (Бм)
Бм = 8,32 г – 5,04 г =3,28 г.
У всій пробі було знайдено, наприклад, 37,3 г лимонні кислоти (п.3.2) .
Продукуюча здатність міцелію (Пзд)
лимонної кислоти синтезується за цикл вирощування 1 г біомаси продуцента.
5. Визначення в середовищі залишкового цукру
Визначення залишкового цукру ведеться за методом Бертрана. Визначення цукру можна вести безпосередньо в культуральній рідини без розведення й гідролізу.
На визначення цукру за методом Бертрана береться 3 – 5 мл культуральної рідини й додається 15 – 17 мл води, 1-ий й 2-ий реактиви Фелінга беруться по 20 мл.
Розраховується кількість цукру в 100 мл культуральної рідини (%) і кількість г залишкового цукру у всій пробі (Vзаг.к.р.)
Приклад розрахунку.
1. В аналізованій пробі знайдено: в 5 мл культуральної рідини, наприклад, 20,8 мг РВ, тоді у всій пробі після збродження буде залишкового цукру (Сзал.заг.):
де 5 мл - це взята на аналіз кількість культуральної рідини; 450 мл – Vзаг.к.р. – загальний обсяг культуральної рідини разом із промивними водами; 1000 – коефіцієнт перерахування в грами.
2. За цими ж даним можна розрахувати процентний вміст залишкового цукру в культуральній рідині в перерахуванні на вихідний розчин.
6. Розрахунок кількості спожитого цукру
На першому занятті по цій лабораторній роботі була розрахована загальна кількість цукру у вихідній пробі на обсяг середовища 400 мл (перше заняття, п. 5.2.).
Воно склало 64,4 г на обсяг проби.
Після культивування залишилося не спожитим 1,872 г.
Тоді кількість спожитого цукру буде дорівнює 64,4 – 1,872 = 62,528 г.
7. Розрахунок виходу лимонної кислоти від спожитого цукру
Відомо, що в пробі утворилося, наприклад, 37,3 г лимонні кислоти, а витратилося в процесі 62,528 г цукру, тоді вихід лимонної кислоти від спожитого цукру буде дорівнювати:
Вихід лимонної кислоти від витраченого цукру буде складати 59,8%.
Додатки
Додаток 1
Застосування органічних кислот
Найменування кислот |
Найменування продукту |
Призначення |
Лимонна кислота |
Хлібний квас, пастила, варення, компоти, лікеро-горілчані вироби, безалкогольні напої, рибні консерви (деякі сорти). Детергенти. Транфузіологічні суміші. Суміші для очищення металів, трубопроводів, казанів і деякого устаткування. Цитрати (калію, натрію, кальцію, магнію, лецитину, амонію). Е-322, Е-331, Е-333, Е-345, Е-344, Е-380 Лікарські препарати: вощені капсули (порошки лимонної кислоти), суппозиторії («Кальцилакс». «Ферролакс»), розчини лікарських речовин (натрію броміду, калію броміду). |
Е-330 Регулятор кислотності, антиокислювач і синергіст антиокислювачів, комплексо-утворювач, диспергуюча, подрібнююча дія. Замінник фосфатів Антикоагулянт крові Утворення хелатних сполук із металами Солі-плавитель, ПАР, консервант, текстуруюча, стабілізуюча речовини. Стимулятор виділення травних соків і перистальтики кишечнику, Втамовувач спраги, допоміжна речовина при виготовленні ліків |
Молочна кислота |
Хлібний квас, вершкове масло, безалкогольні напої, пиво (деякі сорти) Лактати (заліза, калію, кальцію, магнію, натрію) Е-585, Е-326, Е-327, Е-329, Е-325 Лікарські препарати: таблетки («Гемостимулін», «Фітоферролактол»), капсули (заліза лактат, кальцію лактат), суппозиторії («Кальциллакс», «Ферролакс») |
Е-270 Регулятор кислотності Стабілізатор кольору, консистенції, синергіст антиокислювачів, покращувач борошна й хліба, регулятор кислотності, вологості, наповнювач. Одержання легко засвоюваної форми заліза й кальцію. |
Глюконова кислота |
Глюконати заліза, калію, кальцію, магнію, натрію (Е-579, Е-577, Е-558, Е-580, Е-576 відповідно) Лікарські препарати: таблетки («Кальцію глюконат», «Кальцію пангамат») Каучук, пластмаси, волокна, інсектициди |
Регулятор кислотності, розпушувач, стабілізатор кольору, диспергуючий засіб, затверджувач, текстуруюча речовина Зниження токсичних вражень печінки гіпоксії, втрат кальцію з організму, протиотрута при отруєнні солями магнію, щавлевої кислоти, кровоспинний засіб, поліпшення обміну речовин. Хімічний реагент для органічного синтезу або сировина |
Оцтова кислота |
Овочеві маринади, вінегрети, столовий оцет (9%) |
Консервант |
Додаток 2
Контрольовані параметри сировини для виробництва лимонної кислоти, стосовно до продуцентів Asp. Niger
Таблиця1
Контрольовані параметри меляс для виробництва лимонної кислоти
Найменування показників |
Вуглеводвмісні субстрати | ||
Бурячна меляса |
Тростниково-цукрові меляси |
Згущений сік сорго | |
Масова частка сухих речовин, % |
75-82 |
80-83 |
55,2-60,4 |
Масова частка цукрів для ферментації, % |
45-50 |
44-50 |
43-46 |
Масова частка редукуючих речовин, % |
0,25-2,0 |
12-18 |
25-30 |
Масова частка колоїдних речовин, % |
6-10 |
10-12 |
5-6 |
Доброякісність |
61-66 |
55-60 |
76-78 |
Значення рН, одиниці рН |
Не нижче 5,5 |
5,5-6,0 |
4,5-5,8 |
Зольність, % |
6-10 |
12-13 |
4,5-5,5 |
Густина розчину, г/см3 |
1,1-1,5 |
1,2-1,6 |
1,0-1,1 |
Масова частка магнію в перерахуванні на MgO, % |
0,03-0,04 |
0,2-0,4 |
0,01-0,014 |
Масова частка заліза в перерахуванні на Fе2O3, % |
0,015-0,025 |
0,03-0,04 |
0,012-0,015 |
Масова частка кальцію в перерахуванні на СаО, % |
0,9-1,1 |
1,0-1,2 |
0,6-0,7 |
Масова частка заг. фосфору в перерахунку на Р2O5, % |
0,02-0,05 |
0,1-0,2 |
0,08-0,1 |
Бурячна меляса – залишок виробництва цукру з буряка (вихід 3,5 – 5% до маси буряка). Вона являє собою матковий розчин, який утворюється при відділенні кристалів сахарози на центрифузі (після третьої кристалізації). Склад меляси непостійний і може коливатися в значних межах залежно від ґрунтових і кліматичних умов вирощування буряка, технології її переробки, умов транспортування й зберігання меляси.
Очеретяна меляса – залишок виробництва цукру з очерету. В Україні цукровий очерет не росте, але очеретяно-сахарні меляси широко застосовуються в багатьох країнах. Хімічні параметри очеретяних меляс та їхні технологічні якості помітно змінюються в процесі зберігання (більше 6 місяців).
Сік сорго – виділяється зі стебел цукрового сорго з наступним концентруванням (в 2,7 рази). Особливістю складу поживних середовищ основі соку сорго є суворе витримування співвідношення вуглецю до азоту, а також азоту до фосфору залежно від фази росту гриба. Як джерело азоту для культивування Aspergillus niger на середовищах, виготовлених зі згущеного соку сорго, використають цитрат амонію.
Таблиця 2
Контрольовані параметри крохмалів для виробництва лимонної кислоти
Найменування показників |
Вуглеводвмісні субстрати | |
Кукурудзяний крохмаль |
Пшеничний крохмаль | |
1 |
2 |
3 |
Масова частка сухих речовин, % |
86,2-88 |
84-87 |
Доброякісність |
92-94 |
90-95 |
Масова частка зольних елементів, % |
0,13-0,18 |
0,4-0,9 |
Масова частка протеїну, % |
1,1-1,3 |
2,9-5,2 |
Масова частка фосфорних сполук у перерахуванні на Р2О5, % |
0,02-0,03 |
0,04-0,07 |
Масова частка мезги, % |
- |
0,2-0,4 |
Мікробне забруднення, клітин на 1 г, не більше |
1-106 - 1-107 |
1-105 - 1-107 |
Гідролізати крохмалю – вуглеводвмісна сировина для мікробіологічного синтезу (лимонної кислоти) одержують ферментативним гідролізом кукурудзяного й пшеничного крохмалю. Дані субстрати мають невисокий ступінь розщеплення поліглікозидних зв'язків (ДЕ не більше 20). Містять: глюкози – 2 – 5 г/дм3, мальтози – 13 – 15 г/дм3, декстрини – 140 – 150 г/дм3. Оптимальним джерелом азоту для поживних середовищ на основі крохмалю є азотнокислий амоній. Максимальний рівень конверсії вуглеводів у лимонну кислоту для гідролізатів з кукурудзяного крохмалю досягається при співвідношенні C/N рівному 75, N/P – 13,5; пшеничного, відповідно, 64 й 10,6.
Додаток 3
Біосинтез лимонної кислоти продуцентами Aspergillus niger
на різній вуглеводвмісній сировині
Штам ВКПМ F-410 отриманий методом автоселекції активних мутантів у сполученні з мутагенезом для безперервного культивування на мелясних середовищах. Як об'єкт селекції взята популяційона суміш виробничих штамів (Л-1; ВКПМ F-171, ВКПМ F-326 і мутанта Л-4-30).
Штам ВКПМ F-501 селекційований методом соматичної гібридизації протопластів міцелію штаму ВКПМ F-410 й активного мутанта, з наступним опроміненням рекомбінантів УФ-променями й добором спонтанних варіантів для ферментації на сахарозомінеральних середовищах.
Штам ВКПМ F-681 отриманий сполученням УФ-опромінення чорно забарвленого варіанта Asp. niger 163/9 зі стабілізуючим добором стійких спонтанних темно-сірих варіантів.
Штам ВКПМ F-696 селекційований з високоактивних мутантів штаму ВКПМ F-681 при УФ-опроміненні (кремове забарвлення конідій). Останні два штами призначені для ферментації сахарозомінеральних і глюкозомінеральних середовищ.
Штам ВКПМ F-719 отриманий у ході східчастої селекції промислового штаму ВКПМ F-171 шляхом впливу УФ-променів з наступним стабілізуючим добором спонтанних варіантів на середовищі зі згущеного соку сорго.
Додаток 4
Міліграми глюкози, що відповідають міліграмам міді (по Бертрану)
Глюкоза |
Мідь |
Глюкоза |
Мідь |
Глюкоза |
Мідь |
Глюкоза |
Мідь |
10 |
20,4 |
36 |
70,1 |
62 |
116,1 |
88 |
158,8 |
11 |
22,4 |
37 |
72,0 |
63 |
117,9 |
89 |
160,4 |
12 |
24,3 |
38 |
73,8 |
64 |
119,6 |
90 |
162,0 |
13 |
26,3 |
39 |
75,7 |
65 |
121,3 |
91 |
163,6 |
14 |
28,3 |
40 |
77,5 |
66 |
123,0 |
92 |
165,2 |
15 |
30,2 |
41 |
79,3 |
67 |
124,7 |
93 |
166,7 |
16 |
32,2 |
42 |
81,1 |
68 |
126,4 |
94 |
168,3 |
17 |
34,2 |
43 |
82,9 |
69 |
128,1 |
95 |
169,9 |
18 |
36,2 |
44 |
84,7 |
70 |
129,8 |
96 |
171,5 |
19 |
38,1 |
45 |
86,4 |
71 |
131,4 |
97 |
173,1 |
20 |
40,1 |
46 |
88,2 |
72 |
133,1 |
98 |
174,6 |
21 |
42,0 |
47 |
90,0 |
73 |
134,7 |
99 |
176,2 |
22 |
43,9 |
48 |
91,8 |
74 |
136,3 |
100 |
177,8 |
23 |
45,8 |
49 |
93,6 |
75 |
137,9 |
|
|
24 |
47,7 |
50 |
95,4 |
76 |
139,6 |
|
|
25 |
49,6 |
51 |
97,1 |
77 |
141,2 |
|
|
26 |
51,5 |
52 |
98,9 |
78 |
142,8 |
|
|
27 |
53,4 |
53 |
100,6 |
79 |
144,5 |
|
|
28 |
55,3 |
54 |
102,3 |
80 |
146,1 |
|
|
29 |
57,2 |
55 |
104,1 |
81 |
147,7 |
|
|
30 |
59,1 |
56 |
105,8 |
82 |
149,3 |
|
|
31 |
60,9 |
57 |
107,6 |
83 |
150,9 |
|
|
32 |
62,8 |
58 |
109,3 |
84 |
152,5 |
|
|
33 |
64,6 |
59 |
111,1 |
85 |
154,0 |
|
|
34 |
65,5 |
60 |
112,8 |
86 |
155,6 |
|
|
35 |
68,3 |
61 |
114,5 |
87 |
157,2 |
|
|
Список використаної літератури
Основы биотехнологии: Учебное пособие для высш. пед. учеб. Заведений / Т.А.Егорова, СМ. Клунова, Е.А. Живухина. – М.: Издательский центр «Академия», 2003. – 208 с.
Смирнов В.А. Пищевые кислоты. – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983.
Инженерные основы биотехнологии. Учебное пособие. // Под ред. проф. Д.Г. Победимского. – М.: МИТХТ, 1998, 388 с.
Мушникова Л.Н. и др. Биоконверсия концентрированного сока сорго в лимонную кислоту. // Новые и нетрадиционные растение и перспективы их практического использования.: Тез. докл. I междунар. симп. Пущино, 1995. – С.679 – 680.
Никифорова Т.А. и др. Тростниковая меласса – сырье для производства пищевой лимонной кислоты. // Хранение и переработка сельхозсырья. – 1996. – № 2. – С. 30-31.
Никифорова Т.А. и др. Некоторые особенности биоконверсии гидролизатов крахмала в лимонную кислоту. // Ресурсосберегающие технологии пищевых производств: Тез. докл. Международной научно-технической конференции. – СПб, 1998. – С. 181-182.
Никифорова Т.А. Продуценты пищевой лимонной кислоты для культивирования в глубинных условиях.: Обзор, инф. АгроНИИТЭИПП – 1995, вып 2. – С.1-21.
Землянухин A.A. Малый практикум по биохимии: Учебное пособие. – Воронеж: Изд-во ВГУ, 1985. – 128 с.
Егорова Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. - М.: Изд-во МГУ, 1995. – 224 с.
Булдаков A.C. Пищевые добавки. Справочник. – Санкт-Петербург, «Ut», 1996. – 240 с.
Справочник фармацевта / Под ред. проф. А.И. Тенцовой. М.: Медицина, 1983. – 377 с.
Пасет Б.В., Антипов М.А. Практикум по техническому анализу и контролю в производстве химико-фармацевтических препаратов и антибиотиков. – М.: Медицина, 1981, 272 с.
Биолоигически активные добавки к пище. Полная энциклопедия / Сост. Н.А.Натарова, -СПб. – 2001. – 384 с.
Щербакова Е.Я. Метод гибридизации прототрофных штаммов Aspergillus niger – продуцентов лимонной кислоты // Вестник Российской академии с/х наук. – 1995. – №3. – С.65-66.
Никифорова Т.А. Штаммы Aspergillus niger – продуценты лимонной кислоты // Хранение и переработ ка сельхозсырья. – 1997. – № 6. – С.25-28.