1. Підготовка посуду для стерилізації

Посуд і матеріали: склянки ємністю 700 – 800 мл і площею дна – 0,4 дм³, вата, марля, вихідний посівний матеріал, фільтри паперові, мірна колба на 50 мл, індикаторний універсальний папір, лійка, конічна колба на 250 мл, 1%-ні розчини: NH₄C1, КН₂РО₄, ZnО₄; 10%-ний р-н K₄[Fe(CN)₆]; глюкоза кристалічна, сахароза кристалічна, розведений р-н меляси, мірні циліндри на 500 мл, 100 мл, піпетки на 10 мл, 5 мл, конічні колби на 500 мл, 5%-ний розчин НС1, насичений розчин Na₂CO₃, розчин J₂, реактив Фелінга А, реактив Фелінга Б, дистильована вода, сірчанокисле залізо в сірчаній кислоті, 0,1 Н перманганат калію.

Устаткування: термостат, рН-метр, рефрактометр, водяна баня, електроплитка, бюретка. Склянки ємністю 700 – 800 мл миються, насухо витираються й закриваються ватномарлевими серветками. Серветки виготовляються з ватяного «полотна», для цього відокремлюється шар вати в 2 – 3 см по можливості рівномірний по товщині й з нього ножицями вирізує коло діаметром 17 – 18 см. Коло вати покривається із двох сторін двома шарами марлі й прошивається квадратами 2×2 см. Серветка повинна бути або прив'язана мотузкою, або схоплена гумкою.

На кожен варіант досліду заготовлюється по дві склянки. Закриті склянки завантажуються в автоклав і стерилізуються 30 хв при 0,5 ати.

2. Готування живильного й з її стерилізація

Варіанти середовищ для культивування гриба Asp. niger штам 119 представлені в табл.2.

Таблиця 2

Номер варіанта	Найменування й вміст джерел вуглецю в середовищі							Кількість мл сольових розчинів, що додаються
	меляса		сахароза		глюкоза			1% р-н NH4C1, КН2РО4, ZnSО4 додається в співвідношенні 1:1:1		10% р-р K4 [Fe(CN)6]		Кількість Н2О
	дозування по цукру, %	мл розведеного р-ну меляси	%	г на варіант	%	г на варіант
1	17,0	850		-	-	-	4,5		10		-
2	13,6	680	3,4	27,2	-	-	4,5		8		2
3	8,5	425	8,5	68,0	-	-	4,5		5		5
4	3,4	170	13,6	108,8	-	-	4,5		2		8
5	-	-	17,0	136,0	-	-	4,5		0,5		9,5
6	13,6	680	-	-	3,4	27,2	4,5		8		2
7	8,5	425	-	-	8,5	68,0	4,5		5		5
8	-	-	-	-	17,0	136,0	4,5		0,5		9,5

Вихідний розчин меляси готується відразу для всіх варіантів, до складу яких входить цей компонент.

1,2 кг меляси заливають 2000 мл киплячої водопровідної води, доводять цей розчин до кипіння й кип'ятять 10 хв. Із цього розчину беруть пробу й визначають у ній рН потенціометричним методом. Для готування середовища рН розчину меляси повинен бути 7,0, тому що рН = 8 затримує проростання спор, а при рН = 4,5 – 5 вони зовсім не проростають.

Залежно від того, яке було рН розчину меляси, його або підлужують содою, або підкисляють 1н H₂SО₄.

Для того, щоб не помилитися, беруть 100 г розведеного розчину меляси, визначають її рН й якщо воно лужне, те потенціометрично відтитровують її з бюретки 1н H₂SO₄. Якщо меляса кисла, то беруть певна масову кількість соди (NaHCО₃) і додають її до стійкого рН – 7,0. Залишок невитраченої соди зважують і за різницею визначають її кількість, необхідну для нейтралізації кислої меляси.

Потім, виходячи з результатів усереднення розчину меляси, роблять розрахунок необхідної кількості соди або 1н H₂SО₄ на всю пробу – 3100 г розчину меляси. Розраховану кількість нейтралізатора вносять у загальний обсяг розчину, ретельно перемішують 5 хв і знову беруть пробу для перевірки рН. Якщо потенціометр показує рН від 6,8 до 7,2 , уважають, що вихідний розчин меляси готовий для подальшого готування середовища. Якщо рН менше або більше, усе повторюється заново, тобто знову проводиться потенціометричне титрування й проводяться відповідні розрахунки.

Після усереднення обсяг меляси доводить до 3500 мл водопровідною водою. У такому розчині буде цукру приблизно в 3 рази менше. Вихідна меляси має вміст цукру 48 – 50%, тобто в 1200 г його буде ~ 600 г, а в розведеному розчині відсоток його понизиться ~ в 3 рази, він буде ~ 17,5%, тобто кожні 100 мл будуть містити 17 г цукру. Цей розчин є вихідним для готування середовища.

У середовищі для промислового культивування Asp. niger штам 119 повинно міститися вуглеводів 16 – 17%, тому у варіантах середовищ вибирається така кількість джерел вуглецю, щоб їх містилося приблизно 16 – 17% (табл.2).

Беруть, відповідно до дозувань, зазначених у табл. 2, необхідну кількість розведеного мелясного розчину, потім вносять у нього, якщо це необхідно, наважки сахарози або глюкози, ретельно перемішують і доводять обсяг до 850 мл. У варіанті 1-ому просто відміряється 850 мл вихідного мелясного розчину, а у варіантах 5-ому й 8-ому наважки цукру розчиняються в гарячій воді й обсяг розчину доводить до 850 мл водою. Далі до 850 мл приготовленого середовища додається, згідно з даними табл. 2, розчини солей і вода. У результаті утворюється вихідний обсяг середовища 850 мл + 4,5 + (Σ=10 мл), рівним 864,5 мл.

Це готове поживне середовище нагрівають до кипіння й кип'ятять 10 – 15 хв, потім його прохолоджують і розливають по 400 мл у дві конічні колби, закривають колби ватяними пробками, паперовими ковпаками й стерилізують в автоклаві при 0,5 ати протягом 30 хв. Після стерилізації колби виймають, прохолоджують і готують до засівання.