Перше заняття

План роботи

1. Готування посівного й ферментаційного середовищ.

2. Визначення рН посівного й ферментаційного середовищ і доведення до рН 7,0.

3. Визначення сухих речовин методом рефрактометрії.

4. Визначення вмісту цукру за методом Бертрана.

Для реєстрації результатів роботи формується нижчеподаний журнал спостереження.

Таблиця 1

№ варіанта	рН ферментаційної, середовища	% сухих речовин	% РВ

1. Готування посівного й ферментаційного середовищ

Одержання спор. Asp. niger вирощують у чашках Петрі на сусло-агаровому середовищі. 7 – 8 добові конідії збирали для наступного культивування в рідкому середовищі. Спори з поверхні чашок збирають рідким способом (5 мл стерильної води).

Посівне сахарозомінеральне середовище: (г/л) сахароза – 12,5; КН₂РО₄ або К₂НРО₄ – 10; MgО₄•7H₂О – 10; (NH₄)₂SО₄ – 10; КС1 – 0,5; FeО₄ – 0,01; ZnО₄ – 0,05. Культивування посівного сахарозомінерального середовища проводиться не менш 36 годин.

Посівне глюкозомінеральне середовище: (г/л) глюкоза – 24; NH₄C1 – 2,0; КН₂РО₄ – 1,0; MgО₄•7H₂О – 0,2; ZnО₄ – 0,01; MnО₄ – 0,005. Культивування посівного глюкозомінерального середовища проводиться не менше 24 годин.

Посівні середовища готуються в кількості 50 мл у колбах на 250 мл. Суспензія спор вноситься в кількості 1 мл.

Культивування проводиться на качалці при 200 об/хв t = 37 – 38°C.

Ферментаційне сахарозомінеральне середовище, (г/л):

Варіант № 1. Сахароза – 30; аспарагін – 1,0; NH₄NО₃ – 0,6; КН₂РО₄ – 1,0; MgО₄•7H₂О – 0,5.

Варіант № 2. Сахароза – 30; аспарагін – 2,0; КН₂РО₄ – 1,0; MgО₄•7H₂О – 0,5; СаСО₃ – 5,0.

Варіант № 3. Сахароза – 30; КН₂РО₄ – 10; MgО₄•7H₂О – 10; (NH₄)₂SО₄ – 10; КС1 – 0,5; FeО₄ – 0,01; ZnО₄ – 0,05.

Ферментаційне глюкозомінералъне середовище, (г/л):

Варіант № 4. Глюкоза – 30; аспарагін – 1,0; NH₄NО₃ – 0,6; КН₂РО₄ – 1,0; MgО₄•7H₂О – 0,5.

Варіант № 5 Глюкоза – 30; аспарагін – 2,0; КН₂РО₄ – 1,0; MgО₄•7H₂О – 0,5; СаСО₃ – 5,0.

Варіант № 6. Глюкоза – 95,0; NH₄C1 – 2,0; КН₂РО₄ – 1,0; MgО₄•7H₂О – 0,2; ZnО₄ – 0,01; MnО₄ – 0,005.

Ферментаційне середовище готується в кількості 100 мл у колбах на 500 мл. Посівне середовище додається з розрахунку 10% до ферментаційного середовища. Культивування проводиться на качалці 200 об/хв t = 28 – 29°С у протягом 7 - 8 діб.

Стерилізують середовища в автоклаві при 0,5 аті протягом 30 хв.

2. Визначення рН посівного й ферментаційного середовищ і доведення до рН 7,0

рН середовища визначається потенціометрично. У якості розчинів для титрування використовують 10%-ні розчини КОН і Н₂SO₄.

3. Визначення сухих речовин методом рефрактометрії

У вихідному середовищу, яке лишилося після розливу в колби визначається вміст сухих речовин методом рефрактометрії. Для цього 10 – 12 мл середовища, при необхідності, профільтровують через складчастий фільтр у пробірку, доводять температуру фільтрату до 20°С и роблять вимірювання показань на рефрактометрі.

4. Визначення вмісту цукру за методом Бертрана

4.1. Інверсія цукру. Інверсія цукру середовища здійснюється за допомогою кислотного гідролізу.

Устаткування й посуд: водяна баня, мірна колба на 50 мл, індикаторний універсальний папір, паперовий фільтр, лійка.

Реактиви: 5%-ний розчин НС1, насичений розчин Na₂СО₃, розчин J₂.

Хід роботи:

У мірну колбу на 50 мл переносять 12,5 мл середовища.

Таблиця 2.

Реактиви, обробка	Кількість, час	Примітка
5%-ний розчин НС1	12,5 мл
Витримка на киплячій водяній бані	20 – 30 хв	Охолодження під струменем холодної води
Na2СО3 насичений розчин	До слабокислої реакції	За індикаторним папером
Н2О	До мітки
Розчин J2	1 – 2 краплі	Перевірка на повноту інверсії
	Фільтрування	Через паперовий фільтр.

Фільтрат використовують для визначення редукуючих цукрів.

4.2. Визначення редукуючих цукрів у середовищі.

Метод заснований на здатності редукуючих цукрів відновлювати лужний розчин оксиду міді (ІІ) в оксид міді (І) й визначення концентрації останньої шляхом впливу на неї розчином сульфату заліза (ІІІ) заліза, підкисленого сульфатною кислотою. Кількість відновленого при цьому заліза визначається титруванням перманганатом калію. Процес зводиться до наступних реакцій:

2СuО + редукуючий цукор → Сu₂O;

Сu₂O + Fе₂(SO₄)₃ + Н₂SO₄ → СuSO₄ + 2FeSO₄ + Н₂O;

10FeSO₄ + 2KMnO₄ + 8H₂SO₄ → 5Fe₂(SO₄)₃ + K₂SO₄ + +2MnO₄+ 8H₂O.

Із цих рівнянь видно, що 1 мл 0,1 н розчину перманганату калію відповідає 6,35 мг міді. Знаючи кількість мілілітрів розчину КМnO₄, які витратили на титрування сульфату заліза, знаходять, кількість міліграмів Cu₂O. По таблиці 1, представленій в додатку 3 визначають кількість глюкози, що відповідає міліграмам міді.

Устаткування й посуд: Конічна колба на 250 мл, електроплитка, паперовий фільтр, лійка, бюретка, універсальний індикаторний папір.

Реактиви: реактив Фелінга А, реактив Фелінга Б, дистильована вода, сульфат заліза залізо в сірчаній кислоті, 0,1 н перманганат калію.

Хід роботи.

Фільтрат, отриманий по пропису підпункту 4.1., у кількості 10 мл поміщають у термостійку конічну колбу на 250 мл.

Таблиця 3.

Реактиви, обробка	Кількість, час	Примітка
Реактив А Реактив Б Кип'ятіння	10 мл 10 мл 3 хв	Перемішування Перемішування Сu2O↓ осад червоного кольору. Рідина над осадом повинна бути синього кольору
Гаряче фільтрування
Н2О, t = 90 – 100°С	Промивання осаду на фільтрі	До повного знебарвлення промивних вод
Розчин FеSO4 у Н2SO4	Розчинення осаду на фільтрі
Н2О, t = 20-30^оC	Промивання фільтра й конічної колби	До відсутності кислої реакції в промивних водах
Фіксація обсягу промивної води
0,1 нКМnO4	титрування	До слаборозового забарвлення

Для обчислення процентного вмісту цукру, обсяг 0,1н розчину перманганату калію, який витратився на титрування множать на титр по міді (6,35 мг) і по довідковій таблиці 1 (додаток 3) знаходять якій кількості глюкози він відповідає. Вміст цукрів (%) обчислюють за формулою:

де Свих – вихідний вміст цукру в середовищі; а – кількість мг глюкози; b – кількість мл промивної води; 1000 – переведення мг у г; 12,5 – обсяг узятої проби для інверсії; 50 – обсяг доведення до мітки; 10 – обсяг узятий для аналізу.