Микробиология_сифилис

Определение

Сифилис – общее инфекционное заболевание, вызываемое бледной трепонемой, склонное к хроническому рецидивирующему течению с характерной периодизацией клинических симптомов, способное поражать все органы и системы, передающееся преимущественно половым путем; может передаваться внутриутробно.

Этиология

Возбудитель сифилиса – бледная трепонема, была открыта в 1905 г. Schaudinn и Hoffmann. По классификации Bergey она относится к отделуGracillicutes, порядку Spirochaetales, семейству Spirochaetoceae, роду Treponema, виду Treponema pallidum, подвиду pallidum.

Род Treponema представлен спиральными бактериями длиной от 5 до 20 мкм, которые образуют туго закрученные правильные или неправильные спирали. Грамотрицательные хорошо окрашиваются серебрением по Морозову, но плохо по Романовскому–Гимзе.

Представители рода – хемоорганотрофы с бродильным метаболизмом, утилизируют аминокислоты и/или углеводы. По типу дыхания – анаэробы или микроаэрофилы. Ферментативная активность очень низкая: каталаза-, уреаза- и оксидазаотрицательны, не восстанавливают нитраты.

Лабораторная диагностика сифилиса

Сифилис весьма многолик, характеризуется богатой палитрой манифестных и латентных форм, полисиндромностью поражений, распознавание которых основывается на комплексном клинико-лабораторном обследовании больного.

Выбор материала для исследования и метода микробиологической диагностики определяется стадией патогенеза болезни. 1 период заболевание – отделяемое шанкра, 2 период – аспират из высыпных элементов, пунктат регионарных лимфатических узлов, 2,3,4 периоды – кровь, 4 период – СМЖ (нейросифилис).

Бактериологическое исследование обычно не проводят, так как доступные методы выделения чистой культуры возбудителя не разработаны.

В связи с тем, что возбудитель сифилиса – Treponema pallidum – в отличие от других микроорганизмов плохо культивируется на питательных средах invitro, а также слабо воспринимает анилиновые красители, все существующие методы ее обнаружения можно подразделить на прямые и непрямые.

Прямые тесты основаны на непосредственном выявлении возбудителей в очагах поражения. К ним относятся: темнопольная микроскопия, RIT (rabbitinfektivitytest) – заражение материалом от больных кроликов, прямой тест с флюоресцентными антителами. Непрямые тесты основаны на выявлении АТ к возбудителю сифилиса в сыворотке крови. Это серологическая диагностика, а также редко используемые гистологические исследования.

Все существующие в настоящее время серологические тесты на сифилис подразделяются на две основные группы:

• нетрепонемные [реакция связывания комплемента с кардиолипиновым АГ (РСКк), реакция микропреципитации (РМП), тест быстрых плазменных реагиновRapidPlasmaReagins (RPR), VeneralDiseaseResearchLaboratory (VDRL), тест с толуидиновым красным – ToluidinRedUnheatedSerumTest (TRUST)];

• трепонемные [реакция связывания комплемента с трепонемным АГ (РСКт), реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ или РИТ), реакция иммунофлюоресценции (РИФ) (за рубежом – FTA – Fluorescenttreponemalanibody) с вариантами: РИФ-200 (FTA-200), РИФ-абс (FTA-abs), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) – за рубежом – Treponemapafluidumhaemagglutinationassay (TPHA), иммуноферментный анализ (ИФА) – за рубежом – Enzymelynkedimmunosorbentasay (ELISA), иммуноблоттинг (WesternBlot)].

Прямая визуализация трепонем методом темнопольной микроскопии является убедительным доказательством трепонемной природы заболевания. Наиболее эффективен этот метод при первичном и вторичном сифилисе, наличии поражения кожи и слизистых оболочек. При микроскопии следует дифференцировать Т. pallidum, подвид pallidum, с нитями фибрина, а также с трепонемами нормальной микрофлоры организма человека – Т. refringens и Т. denticola. Т. refringens колонизирует слизистые оболочки наружных половых органов и отличается выраженной подвижностью и отсутствием сгибательных движений. Т. denticola колонизирует слизистую оболочку ротовой полости, ее завитки короче и направлены под более острым углом.

Темнопольная микроскопия обладает чувствительностью 74–86% и специфичностью до 97% в зависимости от квалификации исследователя. Чувствительность может снижаться, если повреждение было протерто антисептиком. Вместе с тем отрицательный результат, обусловленный различными факторами, не является основанием для исключения диагноза сифилиса и требует дальнейшего подтверждения методами серологической диагностики. Кроме того, с помощью этого метода невозможно наблюдать за динамикой инфекционного процесса и оценивать эффективность терапии.

Прямой тест на Т. pallidum с флюоресцентными антителами (DFA-TP) использует флюоресцеинконъюгированные АТ для окраски организма в мазках и срезах тканей. DFA-TP не требует подвижных организмов, является более чувствительным и специфичным, но более дорогим и технически сложным, чем темнопольная микроскопия. На чувствительность обоих микроскопических методов может отрицательно повлиять давность возникновения или состояние повреждения, а также то, получал ли пациент лечение.

Множественный ПЦР с одновременным определением Т. pallidum, вируса герпеса типа 2 и Haemophilisducreyi используется для постановки этиологического диагноза у пациентов с GUD (genitalulcerdisease), а также для обоснования алгоритмов синдромного лечения. Поскольку ПЦР-методики для сифилиса коммерчески недоступны, они остаются инструментом исследователей. Заражение сифилисом лабораторных животных как метод прямой детекции бледной трепонемы не применяется для клинической лабораторной диагностики сифилиса из-за дороговизны, трудоемкости, длительности получения результата, необходимости содержания вивария. Наиболее чувствительным и удобным лабораторным животным для привития сифилиса является кролик. Заражение кроликов производят инокуляцией инфекционного материала в яичко. Чувствительность кроликов к инфекции Treponemapallidum достигает 100%, если во взятом для прививки материале содержится достаточное количество бледных трепонем. В настоящее время он используется только в крупных исследовательских центрах в качестве «золотого стандарта» для оценки чувствительности других тестов.

В нетрепонемных тестах применяется АГ нетрепонемного происхождения (как правило, кардиолипин-лецитин-холестериновый АГ). АТ к фосфолипидным АГ на поверхности трепонем дают перекрестную реакцию с кардиолипиновыми АГ млекопитающих. Флоккуляционные (хлопьеобразующие) методики для обнаружения этих АТ к фосфолипидам были разработаны как неспецифичные скрининговые тесты. К ним относятся РМП и ее модификации: RPR-, VDRL-, TRUST-тест. В данных тестах обнаруживаются IgG- и IgM-АТ к липидам клеточной стенки Т. pallidum, которые появляются в крови примерно через 1 нед после формирования твердого шанкра.

Скрининговые тесты имеют свои плюсы и минусы. К плюсам нетрепонемных тестов можно отнести их невысокую стоимость, сравнительно короткое время для получения ответа при постановке отдельных тестов, пригодность для проведения скрининга большого количества образцов. К минусам большинства нетрепонемных тестов относят их сравнительно низкую чувствительность при первичном (70—90%) и позднем (30—50%) сифилисе, наличие феномена прозоны в отдельных случаях (появление ложноотрицательных или слабоположительных результатов при наличии избыточного количества антител в неразведенной исследуемой сыворотке (блокировка реакции антиген-антитело), в то время как при разведении исходной сыворотки получаются резко положительные результаты). Нетрепонемные тесты дают ложноположительные результаты почти в 2,5% случаев, чаще у женщин. Основные причины ложноположительных нетрепонемных тестов: аутоиммунные заболевания (ревматизм, системная красная волчанка, системная склеродермия, узелковый периартериит, криоглобулиновая пурпура, саркоидоз), онкологические заболевания и болезни крови, некоторые вирусные и бактериальные инфекции, малярия, цирроз печени, наркомании, алкоголизм, беременность, эндокринные заболевания (сахарный диабет, аутоиммунный тиреоидит), старческий возраст и др.

Трепонемные тесты, такие как РСКт, РИБТ или РИТ, РИФ (за рубежом – FTA и FTA-ABS), РПГА (TPHA или ТРРА), используются для подтверждения позитивных скрининговых тестов, распознавания ложноположительных результатов нетрепонемных тестов, при клиническом, эпидемиологическом и анамнестическом подозрении на сифилис, для диагностики скрытых форм заболевания. В трепонемных тестах применяются АГ трепонемного происхождения.

1. Реакция Вассермана

Самой привычной и испытанной временем является реакция Вассермана (РВ) на сифилис. Для ее проведения берут 5 мл крови из локтевой вены, из пробы получают сыворотку, инактивируют собственный комплемент и потом одну часть обрабатывают трепонемным антигеном, а другую – кардиолипиновым.Результат оценивают по скорости гемолиза (интенсивность оценивается от ++++ до -). Первый период сифилиса характеризуется отрицательной реакцией Вассермана, у 50% людей она становится положительной не ранее, чем через 2-3 недели после появления твердого шанкра. Во 2 и 3 периоде – 75-90% (+). После успешного лечения – снова отрицательная.

2. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

Препарат для теста готовят из эритроцитов животных путем сенсибилизации антигеном Treponemapallidum. Клетки добавляют к сыворотке крови пациента. Время проведения теста – 1 час. В присутствии антител происходит реакция агглютинации, а лаборант видит специфические рисунки в микролунках.

• Расшифровка теста: кольцо из агглютинированных клеток – положительный результат (4+, 3+, 2+);

• неплотное кольцо – сомнительный результат (+/-, 1+);

• точка в центре – отрицательный результат (-).

РИТ и РИФ обладают более высокой чувствительность (74–94 и 84–99%) и специфичностью (99 и 97% соответственно). Метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси бактерий обрабатывают антителами антимикробной диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся с антигенами, отмывают, а оставшиеся антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс антигены + антитела + антиглобулины антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе.

В основе РИБТ лежит способность сыворотки больного сифилисом обездвиживать бледные трепонемы, в то время как сыворотка здоровых людей этой способностью не обладает. Реакция ставится в условиях анаэробиоза.В мировой практике метод РИБТ в настоящее время не применяется.

отрицательный	иммобилизация до 20 % бледных трепонем
слабоположительный	иммобилизация от 21 до 50 % бледных трепонем
положительный	иммобилизация от 51 до 100%

Иммуноблоттинг предполагался как альтернатива РИФ-абс (FTA-ABS) в качестве подтверждающего теста. Он более чувствителен, чем РИФ-абс (FTA-ABS), но менее чувствителен, чем РПГА (ТРРА). Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг - от англ, blot, пятно) из геля на активированную бумагу (1) или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с "блотами" антигенов^*. На эти полоски наносят сыворотку больного (2). Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека (IgMили IgG), меченную ферментом (3). Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата (4), изменяющего окраску под действием фермента.IgG-иммуноблотинг (IgGWesternblot)по чувствительности и специфичности соответствует РИФ-абс.IgM -иммуноблотинг (IgMWesternblot) применяется как диагностический тест при врожденном сифилисе.

В последние годы в отечественную практику лабораторной диагностики сифилиса внедряются стандартизированные высокоинформативные методы серодиагностики – ИФА и РПГА. Принцип ИФА заключается в соединении комплекса АГ-АТ с конъюгатом, содержащим ферментную метку (пероксидаза). После инкубации с субстратом и индикатором оценивают ферментативную активность по интенсивности окраски. РПГА применяется для выявления специфических АТ к T. pallidum в сыворотке крови: при соединении АГ T. pallidum со специфическими АТ в реакции на микропланшете наблюдается феномен агглютинации эритроцитов (плотное кольцо -  положительно, неплотное кольцо – сомнительный результат, точка – отрицательный).

НТТ – отрицательные, ТТ – отрицательные. Подобное сочетание может наблюдаться в следующих случаях:

а) Обследуемый пациент здоров и никогда не страдал сифилисом.

б) Первичный сифилис на первой неделе развития. Показано, что у 30—40 % больных с положительными результатами темнопольной микроскопии определяются отрицательные НТТ и у 25 % — отрицательные ТТ.

в) Больные первичным сифилисом после лечения. Спустя 6—12 месяцев после лечения НТТ становятся отрицательными практически у 98—100 %, а ТТ – у 25—50 % больных.

2.      НТТ – отрицательные, ТТ – положительные. Такое сочетание серологических тестов может наблюдаться при ранних формах манифестного сифилиса после успешного лечения, у больных первичным сифилисом, когда сероконверсия НТТ отстает от таковой при ТТ; при вторичном сифилисе и феномене прозоны; при позднем нелеченом сифилисе НТТ бывают отрицательными у 20—40 % больных; при биологически ложноположительных ТТ, наблюдающихся у больных аутоиммунными заболеваниями, у онкологических и инфекционных больных, у беременных; в терминальной стадии ВИЧ-инфекции.

3.      НТТ – положительные, ТТ – отрицательные. Это сочетание чаще всего встречается при биологически ложноположительных серологических реакциях у названных контингентов больных аутоиммунными, онкологическими и инфекционными заболеваниями, лепрой, а также у лиц преклонного возраста и наркоманов.

4.      Сочетание положительных НТТ и ТТ наблюдается у нелеченых больных сифилисом в любой стадии инфекции, у леченых больных поздним сифилисом, серорезистентным сифилисом, при других трепонематозах (фрамбезия, беджель, пинта), при боррелиозе, ложноположительные НТТ и ТТ — у больных системной красной волчанкой и другими заболеваниями с аномальной или избыточной продукцией антител.

В настоящее время разрабатываются новые диагностические методы, основанные на выявлении молекулярных маркеров органных поражений при сифилисе методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ-МС). Привлечение в арсенал методов лабораторной диагностики сифилиса ГХ-МС позволяет с высокой степенью достоверности определить наличие T. pallidum в организме по наличию специфического молекулярного маркера. В соответствии с данными исследованиями было показано, что биохимический состав сыворотки крови больных сифилисом отличается от сыворотки здоровых доноров. В сыворотке крови больных сифилисом присутствуют липидные, углеводные и аминокислотные компоненты, которые могут служить молекулярными маркерами присутствия T. pallidum в организме (К.А.Осман, 2004). Также методом ГХ-МС были установлены химические соединения, являющиеся молекулярными маркерами органных поражений на ранних стадиях заболевания. По данным исследования К.А. Осман (2004 г.), такими соединениями при поражении ЦНС являются D-галактоза, D-трентол, глюкоза и ее циклический изомер – инозитол, при поражении печени – ароматические производные жирных кислот (фенилпропионовая и фенилуксусная кислота), аминокислотные фрагменты, липидно-белковый комплекс, при поражении костей – летучие жирные кислоты, липополисахариды. Таким образом, привлечение в диагностический арсенал методов газовой хроматографии и масс-спектрометрии позволяет с высокой степенью достоверности определить наличие поражения органов и систем при отсутствии положительных серологических реакций и выраженных клинических проявлений болезни.

Новые методы (журнал Вестник дерматологии и венерологии).

Получение рекомбинантного белка ТрF1, цитоплазматического бактериоферритина T. pallidum, и исследование его иммуногенности на образцах сыворотки крови, полученных от больных различными формами сифилитической инфекции и от здоровых добровольцев. Проведена гетерологическая экспрессия белка ТрF1 в клетках E. coli и очистка полученного ТрF1 с помощью аффинной хроматографии на металл-хелатном сорбенте. Далее рекомбинантный ТрF1 использовали в качестве антигена для определения специфических IgG к исследуемому белку в сыворотках крови больных первичным, вторичным, и ранним/ поздним скрытым сифилисом. Показано, что антитела к ТрF1 обнаруживаются на всех стадиях сифилиса, однако их уровень у больных вторичным, ранним и поздним скрытым сифилисом статистически достоверно отличался от такового в группе здоровых добровольцев. Наибольшее различие было отмечено в группах скрытого сифилиса. Полученные данные характеризуют белок ТрF1 как перспективный антиген для диагностики сифилитической инфекции. Кроме этого, ТрF1 можно расценивать как потенциальный антиген для проведения диференцированной диагностики скрытых форм сифилиса.

Иммуноферментный анализ (ИФА) белка ТрF1 на выборке сывороток крови больных сифилисом и здоровых добровольцев. Для исследования иммуногенности белка ТрF1 были применены образцы сыворотки крови следующих групп больных: 20 больных первичным сифилисом, 21 больного вторичным сифилисом, 20 больных скрытым ранним сифилисом и 16 больных скрытым поздним сифилисом. В качестве группы контроля применяли сыворотку крови (9 образцов) здоровых добровольцев, не имевших в анамнезе указаний на заболевание сифилисом и показавших отрицательные результаты исследования.

С использованием методов генной инженерии разработана технология получения рекомбинантного варианта новых целевыхбелков T. pallidum Tp0453 и Tp0319. Белок Tp0453 является гипотетическим белком наружной мембраны возбудителя сифилиса. Данный белок представляет интерес для серодиагностики си- филиса в связи с предполагаемой локализацией на наружной мембране возбудителя, высокой иммуногенностью и отсутствием гомологов среди бактерий других родов. Белок Тр0319 (TmpC, PnrA) — мембранный липопротеин T. pallidum, предположительно ABC-транспортный белок. Предположительно данный липопротеин является заякоренным во внутренней мембране посредством липидной части молекулы.

В соответствии с разработанной технологией были получены очищенные рекомбинантные белки T. pallidum Tp0319 и Tp0453. Эти белки были использованы в качестве антигенов в составе твердофазного иммуносорбента для выявления специфических IgG к исследуемому белку в сыворотке крови больных с разными формами приобретенного сифилиса. Применение полученного рекомбинантного белка позволило выявить антитела к T. pallidum в сыворотке крови больных сифилисом (первичным, вторичным, скрытым ранним и поздним). При исследовании образцов сыворотки крови, полученных от здоровых доноров, антитела не обнаруживались. Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о возможности использования полученного рекомбинантного белка Тр0319 в качестве дополнительного антигена при диагностике сифилиса. Включение нового антигена в состав иммуносорбента тест-систем для диагностики сифилиса (в формате иммуноферментного анализа, иммуноблотинга) расширяет возможности серологической диагностики данного заболевания за счет увеличения спектра определяемых антител к T. pallidum.