Литература БФХ / molekuljarnaja biologija kletki v2

191

курентное подавление), то исследуемый белок выполняет функцию σ-субъединицы.

Основные типы механизмов, регулирующих инициацию транскрипции генов у бактерий, представлены на рис. 10-19. Бактериальные системы будут рассмотрены и при обсуждении того, как при конкурентном взаимодействии между белками-регуляторами, может осуществляться молекулярное переключение.

10-11

10.2.6. Потребность в общих факторах транскрипции приводит к появлению дополнительных элементов в системе контроля транскрипции эукариотических генов [14]

Транскрипция у эукариот - гораздо более сложный процесс, чем транскрипция в прокариотических клетках. Три РНК-полимеразы эукариот (полимеразы I, II и III) эволюционно родственны ферменту бактерий, но содержат большее число субъединиц. До сих пор эти ферментативные комплексы охарактеризованы неполностью. Кроме того, бактериальная полимераза узнает последовательность ДНК, а эукариотический фермент обычно ориентируется на комплекс ДНК-белок, образуемый факторами транскрипции.

Здесь и дальше в этом разделе мы будем в основном рассматривать РНК-полимеразу II, синтезирующую все предшественники мРНК. Важной частью комплекса ДНК—белок, который узнается этой полимеразой, является ТАТА-фактор, известный также как фактор транскрипции IID(TFIID). Этот белок связывается с консенсусной последовательностью «ТАТА-боксом»-ТАТААА. Обычно эта последовательность расположена на участке — 25 - — 30 по отношению к сайту инициации транскрипции. Для многих генов, кодирующих белки, положение этой последовательности очень важно как для активности промотора, так и для точного определения сайта инициации цепи РНК. Подобно белкамрегуляторам, ТАТА-фактор представляет собой белок, специфически связывающийся с ДНК. Так как этот белок необходим для транскрипции большинства (а возможно и всех) генов, транскрибируемых полимеразой II, считают, что он служит составной частью общего механизма транскрипции, а не является белком-регулятором. Результаты опытов, проведенных in vitro, свидетельствуют о том, что после связывания ТАТАфактора с ДНК в области промотора, этот фактор обычно остается в составе стабильного транскрипционного комплекса, участвующего в многократных циклах транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой II (см. рис. 9-69).

Представляется вероятным, что все механизмы, используемые бактерией для контроля активности РНК-полимеразы, реализуются и в эукариотических клетках (см. рис. 10-19). Однако образование стабильного транскрипционного комплекса на ДНК с участием ТАТА-фактора несомненно усложняет регуляцию генов у эукариот. На основании опытов in vitro можно сделать вывод, что основная функция некоторых активирующих белков у эукариот состоит в том, что они помогают ТАТА-фактору соединиться с ДНК в области промотора.

10-11

10.2.7. Большинство генов эукариот находится под контролем промоторов и энхансеров [15]

Методы генной инженерии значительно расширили наши возможности при изучении генов эукариот. Исследователь может по своему

усмот-

192

рению перестроить нуклеотидную последовательность любого фрагмента ДНК, получить множество копий этой последовательности и присоединить ее к любому другому гену, создав, таким образом, новый ген. Для того, чтобы судить о функции сконструированного гена, его либо вводят путем трансфекции в культивируемые клетки, либо (что гораздо сложнее) получают трансгенное животное, у которого этот ген стабильно включился в одну из хромосом.

Использование всех этих методик позволило идентифицировать регуляторные области эукариотических генов даже в отсутствие какихлибо прямых данных о связывающихся с ними белках-регуляторах. Оказалось, что участок ДНК вблизи сайта инициации синтеза РНК чрезвычайно важен для успешной транскрипции (элемент, расположенный перед промотором). Обычно он насчитывает в длину около 100 нуклеотидных пар и включает в себя ТАТА-бокс. Еще большее удивление вызвал тот факт, что для эффективной транскрипции нужны последовательности, довольно значительно удаленные от промотора (энхансеры). Как и в случае сайта связывания белка ntrC у бактерий, энхансеры у эукариот воздействуют на транскрипцию, находясь на расстоянии.

Первый изученный энхансер представляет собой небольшой фрагмент генома вируса SV40, усиливающий транскрипцию вирусных генов, продукт которых необходим на ранних стадиях инфекции. В 1981 г. было показано, что если к гену -глобина присоединить этот небольшой фрагмент вируса, то уровень транскрипции гена β-глобина повышается более чем в 100 раз. Меняя положение и ориентацию этого участка вируса SV40, удалось сформулировать следующие выводы. Энхансер - это регуляторная последовательность ДНК, которая:

1)активирует транскрипцию со связанного с ней промотора, причем транскрипция начинается с обычного сайта инициации синтеза РНК;

2)действует в двух ориентациях (нормальная или инвертированная);

3)оказывает влияние, находясь на расстоянии более 100 нуклеотидных пар в обе стороны от промотора.

В настоящее время известно, что в регуляции большинства генов высших эукариот участвуют элементы, расположенные непосредственно перед промотором, и один или два энхансера, лежащие вдали от сайта инициации синтеза РНК (см. рис. 10-22, А). Хотя обычно энхансеры находятся на расстоянии нескольких тысяч нуклеотидных пар от регулируемого ими промотора, некоторые из них могут быть удалены более чем на 20000 нуклеотидных пар. Как энхансеры, так и элементы, расположенные перед промотором, соединяются с сайт-специфическими ДНК-связывающими белками, которые и опосредуют их действие. Часть этих регуляторных белков, по-видимому, присутствует во всех тканях, тогда как другие обнаруживаются только в определенных типах клеток.

10-11

10.2.8. Большинство энхансеров и элементов, расположенных перед промотором, - это последовательности, которые связывают белки, участвующие в комбинационном контроле [15, 16]

Активность каждого энхансера и элемента, расположенного перед промотором, обычно направлена на участок последовательности длиной от 100 до 200 нуклеотидных пар. Элемент такого размера содержит сайты связывания многих белков, и, как правило, может быть разделен методами генетической инженерии на меньшие, частично сохраняющие активность фрагменты ДНК. Функционирование обоих типов регуляторных последовательностей зависит от связывания специфических бел-

193

Рис. 10-20. А, Конструирование ряда мутантов по регуляторной области путем олигонуклеотиднаправленного мутагенеза. У каждого мутанта изменен блок из четырех нуклеотидных пар. Таким образом, для изучения 108 нуклеотидов в энхансере β-глобина необходимо получить 27 последовательных мутантов. Б. Встраивание мутантного энхансера β-глобина в специальную тест-плазмиду. Олигонуклеотид и клонирующий сайт

«сшиваются» ДНК-лигазой. Белок, образуемый рекомбинантным геном, представляет собой бактериальный фермент хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), активность которого легко определить. В. Исследование мутантных энхансеров по их воздействию на синтез РНК. Синтез РНК измеряется косвенным образом по количеству белка, образуемого рекомбинантным геном (т. е. по активности CAT).

ков и потому часто ограничено тем типом клеток, в которых эти белки имеются. Лишь некоторые регуляторные элементы (такие, как энхансер вируса SV40) могут проявлять активность почти во всех клетках. Большинство энхансеров характеризуются ярко выраженной специфичностью и активны в клетках, экспрессирующих именно тот ген, с которым они обычно связаны. Примером может служить энхансер гена β-глобина курицы.

Энхансер β-глобина курицы расположен позади транскрипционной единицы β-глобина. В последовательных поколениях эритроцитов (и только в них), он образует гиперчувствительный к нуклеазе сайт. Этот факт свидетельствует о том, что в эритроцитах с энхансером связаны белкирегуляторы. Для того чтобы идентифицировать их, следует определить, какая именно последовательность нуклеотидов необходима для проявления активности энхансера. Для этого мутантные последовательности энхансера объединяли с маркерным геном. Продукт такого гена легко определить; это дает возможность судить о влиянии любой мутации энхансера на транскрипцию: каждую рекомбинантную конструкцию вводили в эритроциты курицы и регистрировали эффективность экспрессии гена-маркера (рис. 10-20). Те нуклеотиды, которые при таком тестировании оказываются необходимыми для активности энхансера, можно считать участками связывания специфических белков. С помощью данной методики было установлено, что таких белков-три (рис. 10-21). Содержание каждого из них в клетке очень мало, но благодаря тому, что сайты их связывания известны, можно клонировать кодирующие последовательности ДНК и, следовательно, получать эти регуляторные белки в неограниченном количестве (см. разд. 9.1.7).

Результаты, полученные при изучении энхансеров и элементов, лежащих перед промотором, позволили сформулировать следующие

выводы.

1.Регуляторные элементы имеют модульное строение и состоят из серии определенных последовательностей нуклеотидов. Каждая такая серия содержит по 8-15 нуклеотидов и соединяется с соответствующей ей серией белков-регуляторов. Некоторые из этих белков присутствуют лишь в отдельных типах клеток, но есть и такие, которые присущи клеткам всех типов,

2.Существуют белки-регуляторы, связывание которых способствует активации транскрипции, другая группа регуляторных белков, напротив, подавляет транскрипцию. Общее воздействие регуляторного элемента зависит от комбинации связавшихся белков, а для каждого отдельного элемента эффект может меняться по мере развития клетки. Например, энхансер способен не только активировать, но и подавлять транскрипцию (см. рис. 10-22, Б). Таким образом, первоначальное название, данное этим элементам, не совсем верно отражает их функцию.

194

Рис. 10-21. Сопоставление данных по активности мутантного энхансера, описанного на рис. 10-20, В с расположением сайтов связывания белков с нормальным энхансером. Цветные полоски на рисунке соответствуют частям нормальной последовательности энхансера, которые

закрываются указанными белками. Эти данные получены при смешивании нормальной последовательности энхансера с экстрактами эритроцитов курицы и последующем анализе смеси методами электрофореза и футпринтинга. Активность выражена как «процент активности энхансера»: цифра 100 означает, что данный мутант стимулирует синтез РНК также, как и нормальный энхансер; 0-синтез РНК не превышает транскрипцию в отсутствие энхансера. Результаты показывают, что наибольший вклад в стимуляцию транскрипции энхансером дают белки API-подобный, АР2подобный и Егуfl, однако по отдельности ни один из этих белков не может обеспечить полноценную активность энхансера (рис. 10-23).

Рис. 10-22. Транскрипционная активность гена определяется совместным действием белков-регуляторов, связанных с элементом, расположенным перед промотором, и белков, связанных с энхансером. А. Типичное расположение двух типов регуляторных элементов

относительно кодирующей последовательности. Б. Примеры совместного действия белков, связанных с этими двумя элементами. В зависимости от того, какие белки связались, каждый отдельный элемент в данном примере обладает либо слабым положительным ( + ), либо сильным положительным (+ +), либо слабым отрицательным (—), либо сильным отрицательным (— —) действием, как это показано на рисунке.

Таблица 10-1. Некоторые хорошо охарактеризованные белки-регуляторы млекопитающих и соответствующие специфические сайты связывания с ДНК.

Название		Масса белка.	Сайт связывания с ДНК2)	Примечания
белка		кДа1)
jun		36	TGANTCA ACTNAGT	Продукт протоонкогена, который может связываться с белком fos, продуктом другого
(или AP1)				протоонкогена. Активность индуцируется С-киназой; родственные белки, кодируемые
				множественными генами
АР2		48	CCCCAGGC GGGGTCCG	Активность индуцируется С-киназой
ATF	(или	43	(TилиG)(ТилиА)CGTCA (А Активность индуцируется А-киназой
CREB)			С)(А T)GCAGT
SP1		85	GGGCGG CCCGCC	Связывается с промоторами многих генов «домашнего хозяйства»
OTF1		90	ATTTGCAT TAAACGTA	Встречается во всех клетках млекопитающих. Один из многих белков, связывающихся
				с одной и той же октамерной последовательностью
NF1 (или CTF)		52-66	GCCAAT CGGTTA	Многие белки, кодируемые альтернативно сплайсируемой РНК, считываемой с одного
				гена
SRF		67	GATGCCCATA	Участвует в кратковременной активации транскрипции протоонкогена fos (и других
			CTACGGGTAT	генов) факторами роста. В виде димера связывается с симметричной
				последовательностью ДНК (указан лишь сайт связывания мономера)

1)ДНК, колирующая каждый из этих белков, была клонирована, и затем определена аминокислотная последовательность соответствующего белка.

2)Во многих случаях известна лишь часть распознаваемой последовательности ДНК. N обозначает любой нуклеотид.

195

Рис. 10-23. Известные белки-регуляторы, контролирующие экспрессию гена β-глобина курицы в ходе нормального развития эритроцита. Здесь суммированы данные экспериментов, описанных на рис. 10-20 и 10-21; аналогичных опытов, проведенных с мутантными элементами, расположенными перед промотором, а также результаты анализа другого типа. А. Связывающие участки белков-регуляторов и их действие. Следует отметить, что энхансер у этого гена расположен за кодирующей последовательностью. Белки, не отмеченные + (активация) или — (подавление), по-видимому, не оказывают существенного влияния на транскрипцию, поскольку мутация их сайта связывания не сказывается на

уровне транскрипции (см. рис. 10-21). Б. Относительные количества регуляторных белков на разных стадиях развития. Числами 0, 1 и 2 обозначено отсутствие, промежуточный и высокий уровень транскрипции соответственно, по нелинейной шкале. Имеющиеся в настоящее время данные не дают точного объяснения, почему ген включается между 4 и 9 днями развития. (С любезного разрешения Gary Felsenield.)

3.Энхансеры и элементы, лежащие перед промотором, по-видимому, связывают много одинаковых белков. Это может означать, что оба типа контролирующих элементов пользуются при воздействии на транскрицию одним и тем же механизмом.

4.При анализе вновь обнаруженных регуляторных элементов генов позвоночных оказалось, что многие из соединяющихся с ними белков охарактеризованы ранее как регуляторы других генов. Возможно, это объясняется тем, что у высших эукариот транскрипция контролируется относительно небольшим числом белков-регуляторов (табл. 10-1). Белки, которые связываются с элементами, лежащими перед промотором, для выполнения своей функции кооперируются с белками, связанными с энхансером. Их суммарный эффект на активность гена - результат взаимоисключающих активирующих и подавляющих воздействий (рис. 10-22). Полагают, что изменение в балансе позитивно и негативно действующих белков-регуляторов обусловливает разную эффективность транскрипции гена β-глобина на разных стадиях развития эритроцита курицы (рис. 10-23).

10-12

10-13

10.2.9. Большинство регуляторных белков содержит домены, функция которых различна [17]

Механизм действия регуляторных белков на гены в большинстве случаев хорошо не изучен. Известно только, что одного связывания с ДНК для влияния на транскрипцию недостаточно. Например, у белка gа14 функции связывания с ДНК и активации транскрипции выполняют разные

196

Рис. 10-24. Описание эксперимента, позволяющего выявить в составе белка-активатора ga14 у дрожжей, независимые ДНК-связывающие и активирующие транскрипцию домены. Функциональный белок-активатор может быть получен при соединении карбоксиконцевой части белка

ga14 и ДНК-связывающего домена бактериального белка-регулятора (белок 1ехА) методом слияния генов. Полученный таким образом бактериально-дрожжевой гибрид будет активировать транскрипцию дрожжевых генов, если перед этими генами встроить специфический сайт, необходимый для его связывания. А. Нормальная активация транскрипции белком ga14. Б. Химерный белок-регулятор для проявления своей активности нуждается в сайте ДНК, связывающем белок lехА. Аналогичные эксперименты продемонстрировали наличие отдельных доменов такого типа и у других эукариотических белков-регуляторов.

Рис. 10-25. Эволюционно родственные белки-регуляторы, принадлежащие к семейству рецепторов стероидных гормонов. Короткие домены, связывающие ДНК в каждом рецепторе, выделены цветом. Опыты по обмену доменов свидетельствуют о том, что многие гормонсвязывающие, активирующие транскрипцию и ДНК-связывающие домены в этих рецепторах могут действовать как взаимозаменяемые модули.

домены. Этот белок-активатор включает транскрипцию многих дрожжевых генов, участвующих в превращении галактозы в глюкозу при выращивании клеток дрожжей на среде с галактозой. Белок ga14 соединяется со специфической последовательностью в 17 нуклеотидных пар, которая у дрожжей выполняет роль энхансера (UAS upstream activating sequence). Белок ga14 содержит около 900 аминокислотных остатков, а для связывания с этой специфической последовательностью размером 17 нуклеотидных пар достаточно аминоконца длиной 73 аминокислотных остатка, который образует серию «цинковых пальцев» (см. разд. 9.1.9). Однако сам по себе ДНК-связывающий домен не способен активировать транскрипцию. Но и в отсутствие этого домена остальная часть последовательности, по-видимому, тоже не активна. Эксперименты по «обмену доменов» показали, что в этом белке функция связывания с ДНК и активации транскрипции присущи разным доменам (рис. 10-24).

Сходные результаты получены и для регуляторных белков млекопитающих. Например, хорошо изучено действие белков-регуляторов, относящихся к семейству рецепторов стероидных гормонов. Эти рецепторные белки обеспечивают ответ клеток на различные липид-растворимые гормоны, активируя или подавляя активность определенных генов, В состав этих белков-рецепторов входит центральный ДНК-сязывающий домен, содержащий около 100 аминокислотных остатков. Как и в случае ga14, этот домен несет серию «цинковых пальцев» и узнает специфическую последовательность ДНК. У некоторых белков, входящих в состав семейства, домен, активирующий транскрипцию, находится на аминоконце. Кроме того, все рецепторы на карбоксильном конце белка содержат гормон-связывающий домен (рис. 10-25). Эксперименты по обмену доменов показали их взаимозаменяемость. Например, замена ДНК-связывающего домена рецепторного белка глюкокортикоида на ДНК-связывающий домен рецептора эстрогена приводит к тому, что

197

модифицированный глюкокортикоидный рецептор связывается с энхансером, который в норме активирует гены, чувствительные к эстрогену. В результате эти гены начинают транскрибироваться в ответ на воздействие глюкокортикоидов, а не эстрогенов. Аналогичным образом введение гормон-связывающего домена глюкокортикоидного рецептора в другой белок-регулятор, не принадлежащий к этому семейству, приводит к тому, что для активности такого модифицированного белка требуются глюкокортикоиды. Каждый из доменов этих рецепторных белков кодируется одним или несколькими отдельными экзонами. Анализ последовательностей ДНК, которые кодируют различные белки, входящие в семейство рецепторов стероидных гормонов (рис. 10-25), дает основание предположить, что каждый белок возник в результате случайных хромосомных обменов, при которых собрались вместе домены разных белков-регуляторов (см. разд. 10.5.4).

10-5

10.2.10. Эукариотические белки-регуляторы могут включаться и выключаться [18]

Подобно другим членам семейства рецепторных белков стероидных гормонов, рецепторы глюкокортикоида и эстрогена напоминают бактериальный белок САР (см. разд. 3.3.6) в том отношении, что они могут активироваться в результате соединения небольших сигнальных молекул с отдельными доменами, которые связывают лиганды. Другие эукариотические белки-регуляторы, вероятно, активируются и инактивируются путем фосфорилирования либо при связывании с другими белками, изменяющими их активность (см. табл. 10-1). Эти и другие известные на сегодняшний день пути контроля активности белков, регулирующих экспрессию генов в клетках эукариот, представлены на рис. 1026.

10.2.11. Механизм действия энхансера до конца не выяснен [15, 19]

Механизмы, регулирующие транскрипцию генов эукариот, демонстрируют высокую консервативность. Например, дрожжевой белок ga14 стимулирует транскрипцию генов млекопитающих в культуре клеток человека, если в этих генах содержится последовательность UAS гена ga14. Сходным образом, если в дрожжевых клетках синтезируется рецепторный белок эстрогена человека, то дрожжевые гены, связанные с энхансером человека, чувствительным к эстрогену, включаются при добавлении этого гормона.

Подобный консерватизм функций не связан с консерватизмом аминокислотной последовательности. Результаты секвенирования многих генов, детерминирующих регуляторные белки у дрожжей и человека, свидетельствуют о том, что домены, ответственные за активацию транскрипции у этих видов, не обладают явным сходством. Как в клет-

Рис. 10-26. Различные способы активации регуляторных белков в эукариотических клетках. Известны примеры для каждого из этих механизмов. А. Белок-регулятор синтезируется лишь в случае необходимости и быстро распадается при протеолизе, таким образом, его накопления не происходит. Б. Связывание с лигандом. В. Фосфорилирование либо другая ковалентная модификация. Г. Образование комплекса с отдельным

белком, который выступает в роли домена, активирующего транскрипцию.

198

Рис. 10-27- Две модели действия энхансера в эукариотических клетках, основанные на образовании петли ДНК, наблюдаемой у бактерий (см. рис, 10-17). В данном примере энхансер расположен перед кодирующей последовательностью, однако петля может образоваться и если

энхансер расположен позади кодирующей последовательности, как в случае гена β-глобина (см. рис. 10-23).

ках дрожжей, так и в клетках человека, достаточный уровень активации генов достигается и в том случае, если домен регуляторного белка, активирующий транскрипцию, замешен на область, богатую кислыми аминокислотами (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота). Этот факт может говорить о том, что механизм активации относительно прост.

Один из предполагаемых механизмов действия энхансера основан на результатах изучения бактериальных систем. Известно, что в клетках бактерий началу транскрипции способствует образование петли ДНК. Это согласуется с данными о том, что энхансеры обычно наиболее эффективны, когда они находятся вблизи промотора; с увеличением расстояния их активность постепенно падает. На рис. 10-27 приведена схема двух вариантов действия энхансера с образованием петли. Предложены и другие гипотезы о механизме действия этого регуляторного элемента. 1. Энхансер может действовать на большом расстоянии, активируя ДНК-топоизомеразу, которая вносит торсионное напряжение в большую петлю ДНК. используя для этого энергию гидролиза АТР. 2. Энхансер может влиять на транскрипцию, действуя как сайт посадки мобильных белков, которые связываются с ДНК и затем движутся вдоль ее молекулы. 3. Энхансер может связывать белки, которые способствуют присоединению близлежащего гена к определенной области ядра, где локализованы факторы транскрипции.

Позже будет показано, что некоторые сайты ДНК оказывают значительное воздействие на транскрипцию, будучи удаленными от промотора на расстояние 50000 и более нуклеотидных пар (см. разд. 10.3.12). Механизм действия таких сайтов, вероятно, отличается от механизма функционирования энхансеров.

Заключение

Упрокариот регуляторные белки обычно связываются со специфическими последовательностями ДНК вблизи сайта инициации транскрипции и либо подавляют, либо активируют транскрипцию соседних генов. Благодаря гибкости ДНК ее молекула может образовывать петли, что позволяет белкам, присоединившимся на некотором расстоянии от промотора, влиять на РНК-полимеразу. Воздействие на расстоянии весьма распространено в клетках эукариот, где экспрессию генов часто контролируют энхансеры, удаленные от промотора на тысячи нуклеотидных пар.

Умногих эукариотических генов, кодирующих белки и транскрибируемых РНК-полимеразой II, непосредственно перед сайтом инициации транскрипции находится последовательность, называемая «ТАТА-бокс».

199

Перед инициацией синтеза РНК необходимо, чтобы фактор, играющий важную роль в транскрипции (ТАТА-фактор, TFIID), образовал стабильный транскрипционный комплекс. Последовательности, примыкающие к ТАТА-боксу, формируют нужный для транскрипции элемент (элемент, расположенный перед промотором). И энхансер, и предпромоторный элемент содержат серию коротких нуклеотидных последовательностей, связывающихся с соответствующими регуляторными белками. Эти белки взаимодействуют друг с другом; в результате этого взаимодействия происходит включение или выключение генов. С помощью методов рекомбинантной ДНК показано, что регуляторные белки часто состоят из нескольких доменов, каждый из которых обладает своей функцией.

10.3. Молекулярно-генетические механизмы, участвующие в образовании разных типов клеток

Вначале этой главы рассматривались разнообразные стратегии регуляции активности генов, позволяющие многоклеточному организму образовывать большое число разных типов клеток. Контролирующим генам свойственна некоторая «экономность». Она проявляется в том, что регуляторные белки образуют различные комбинации. Вероятно, этим можно объяснить тот факт, что с регуляторными последовательностями большинства генов высших эукариот связывается много белков. Существование дискретных типов клеток подразумевает, что активность белковрегуляторов в этой комбинаторной сети подчиняется сложной иерархии обратных связей, которые, по-видимому, управляются небольшим числом главных регуляторных белков. Однако логика построения этой сложной сети регуляции генов еще неясна. Например, непонятно, каким образом кратковременный синтез в неподходящем месте главного белка-регулятора гена Antennapedia у дрозофилы превращает антенну в ногу?

Вданном разделе мы не ответим на этот конкретный вопрос, но постараемся проанализировать, как сеть, контролирующая активность генов, осуществляет переключения, которые сохраняются в последующих поколениях клеток. Клеточная память является основным условием образования и поддержания стабильности дифференцировавшихся клеток.

Начнем обсуждение этой проблемы с рассмотрения хорошо изученных механизмов дифференцировки в клетках бактерий и дрожжей, хотя некоторые из них, как установлено, не свойственны клеткам высших эукариот.

10-16

10.3.1. У многих бактерий некоторые последовательности ДНК перестраиваются, что приводит к включению и выключению генов [20]

Как отмечалось выше, дифференцировка клеток высших эукариот обычно происходит без заметных изменений в последовательности ДНК (см. разд. 10.1.2). Однако у многих прокариот стабильно наследуемый паттерн регуляции генов достигается путем специальной перестройки ДНК, активирующей или инактивирующей определенные гены. В связи с тем, что все изменения в последовательности ДНК будут точно скопированы в ходе последующих репликаций, изменение состояния активного гена унаследуется всеми потомками клетки, в которой произошла перестройка. Некоторые из таких перестроек в принципе обратимы, и через

200

Рис. 10-28. Альтернативная транскрипция двух генов у бактерии Salmonella в результате сайт-специфической рекомбинации, приводящей к инверсии небольшого фрагмента ДНК. Механизм рекомбинации описан выше (см. разд. 5.4.7) и активируется лишь изредка (примерно один раз за

каждые 105 клеточных делений). Таким образом, альтернативное образование флагеллина Н12 (А) либо флагеллина Н1 (Б) обычно строго наследуется в каждом клоне клеток.

какой-то достаточно длинный промежуток времени может произойти переключение гена на другой тип активности.

В качестве примера механизма такого типа дифференцировки клетки можно привести перестройку у бактерии Salmonella. В этом случае определенный фрагмент ДНК размером 1000 нуклеотидных пар инвертируется в ходе реакции, катализируемой ферментом сайт-специфической рекомбинации (рис. 10-28). Итак, ДНК в этом сайте может находиться в двух состояниях. Влияние инверсии на экспрессию гена объясняется тем, что внутри фрагмента размером 1000 нуклеотидных пар находится промотор, ответственный за синтез определенного белка (названного флагеллином), который локализован на поверхности бактериальной клетки. Если этот промотор находится в одной ориентации, то образуется белок одного типа, а если промотор оказывается в другой ориентации-синтезируется другой белок. Поскольку такое переключение происходит очень редко, клоны клеток растут с одним или другим типом флагеллина. Этот феномен носит название фазовой вариации. Скорее всего такой механизм дифференцировки помогает популяции бактерий защищаться от иммунного ответа организма хозяина. Если у хозяина образуются антитела к одному типу флагеллина, некоторые бактерии, флагеллин которых оказался измененным вследствие перестройки генов, смогут выжить и размножиться.

У бактерий из природных популяций часто наблюдается фазовая вариация по одному или нескольким фенотипическим признакам. Подобная «нестабильность» обычно исчезает у стандартных лабораторных штаммов, и поэтому изучено очень мало соответствующих механизмов. Не все из них связаны с инверсией ДНК. Например, бактерия, вызывающая гонорею у человека (Neisseria gonorrhoeae), защищается от иммунного ответа благодаря наследуемой вариабельности свойств клеточной поверхности, возникающей вследствие конверсии генов (см. разд. 5.4.6). Этот механизм зависит от белка rесА, который участвует в рекомбинации, и основан на переносе определенной последовательности из молчащей «кассеты» в главный ген (см. разд. 10.3.2). При этом может образовываться более 100 вариантов основного белка поверхности бактериальной клетки.