Литература БФХ / molekuljarnaja biologija kletki v2

131

па существует в среднем около 10 минут; 3) нуклеосомы в активном хроматине селективно связывают два близкородственных небольших хромосомных белка HMG14 и HMG17. Так как эти белки присутствуют только в активном хроматине, их количество строго соответствует тому, которое требуется для связывания примерно одной из каждой 10 нуклеосом. Аминокислотные последовательности обоих белков крайне консервативны, что свидетельствует о важности их функции; 4) у некоторых организмов, например у Tetrahymena, активный хроматин в значительной мере обогащен минорной формой гистона Н2А. Подобная разновидность гистона найдена также у дрозофилы, курицы и человека. Любое из описанных свойств может играть важную роль в развора-чивании хроматина и таким образом способствовать синтезу РНК, однако для подтверждения этой гипотезы требуется проведение прямых экспериментов. Дальнейшие биохимические исследования можно проводить с использованием новых методов очистки активного хроматина на основе селективного связывания с аффинным матриксом, который содержит антитела, специфические либо к белку HMG, либо к ацетилиро-ванному лизину. В гл. 10 обсуждаются механизмы контроля образования активного хроматина.

9.2.10. Гетерохроматин сильно конденсирован и транскрипционно неактивен [30]

Доказательства существования второй необычной формы хроматина были получены в 1930 г., когда при наблюдении в световом микроскопе интерфазного ядра клетки высших эукариот была обнаружена особая конденсированная форма хроматина, названная гетерохроматином (менее конденсированная часть хроматина была названа эухроматином). Гетерохроматин в интерфазе остается необычайно компактным, сохраняя такую структуру, которую большая часть хроматина приобретает только в митозе. Позднее обнаружилось, что как и митотический хроматин, Гетерохроматин транскрипционно неактивен (рис. 9-53). Полагают, что в большинстве клеток около 90% хроматина транскрипционно неактивно. Хотя относительная устойчивость такого неактивного хроматина к обработке нуклеазой свидетельствует в пользу того, что этот хроматин более конденсирован, чем 10% в транскрипционно

Рис. 9-53. Радиоавтограф тонкого среза ядра клетки, подвергнутой импульсному мечению [3Н]-уридином для выявления областей активного синтеза РНК (гранулы серебра). Светлые участки - области гетерохроматина, который обычно концентрируется вдоль внутренней

поверхности ядерной оболочки. Светлая окраска участков гетерохроматина обусловлена особенностями метода приготовления препарата. Синтез РНК наблюдается главным образом в эухроматино-вых участках, окружающих области гетерохроматина. (С любезного разрешения Stan Fakan.)

132

Рис. 9-54. Участок политенной хромосомы дрозофилы в фазово-контрастном (вверху) и флуоресцентном (внизу) микроскопе после иммунофлуоресцентного мечения гетерохроматина (слева) и активного хроматина (справа). А. Окрашивание моноклональными антителами,

специфичными к белкам, содержащимся в гетерохроматиновых областях. Окрашены хромоцентр (указан стрелкой) и несколько отдельных дисков. Б. Окрашивание моноклональными антителами, специфичными к белкам, содержащимся в активном хроматине. Окрашивается часть дисков. (Л-по Т.С. James and S.C.R. Elgin, Моl. Cell Biol. 6: 3862 3872, 1986; Я-по G.C. Howard, S.M Abmayr, Z.A. Shinefeld, V.Z. Sato and S.C.R. Elgin, J. Cell Biol.

88: 219-225, 1981. © 1981 Rockefeller University Press.)

активных областях, лишь часть его (возможно от 10 до 20%) обладает сильно конденсированной конформацией, известной под названием гетерохроматин. Таким образом, гетерохроматин, вероятно, представляет собой особый класс транскрипционно инертного хроматина, несущего определенные функции. У млекопитающих и многих других высших эукариот ДНК, окружающая каждую центромеру, состоит из относительно простых повторяющихся нуклеотидных последовательностей; именно такие «сателлитные ДНК» составляют основную часть гетерохроматина этих организмов.

У дрозофилы в виде гетерохроматина организованы как хроматин центромеры, так и случайно разбросанные короткие участки. Подобные гетерохроматиновые области недореплицируются на ранних стадиях синтеза ДНК, т. е. в тот период, когда происходит образование политенной хромосомы. Таким образом, эти последовательности в политенных хромосомах представлены в относительно меньших количествах. Биохимические особенности этого типа гетерохроматина можно изучать на молекулярном уровне, проводя связывание с антителами, выявляющими белки хромосом, которые присутствуют только в гетерохроматине (рис. 9-54). Перспективным для биохимического анализа гетерохроматина представляется и клонирование генов, кодирующих специфические для него белки.

Заключение

Все хромосомы во время митоза подвергаются значительной конденсации. Специальное окрашивание выявляет на митотических хромосомах полосы, благодаря которым можно совершенно точно идентифицировать каждую хромосому. Эти полосы, насчитывающие миллионы нуклеотидных пар ДНК, выявляют в хромосоме значительную гетерогенность, природа которой пока еще неясна.

Во время интерфазы хромосомы обычно подвергаются деконденсации в такой степени, что их структура становится трудноразличимой. Замечательным исключением являются специализированные хромосомы типа ламповых щеток в ооцитах позвоночных и политенные хромосомы гигантских секреторных клеток насекомых. Изучение этих двух разновидностей интерфазных хромосом показало, что каждая длинная молекула ДНК, входящая в состав хромосомы, состоит из большого числа

133

дискретных, по-разному упакованных доменов. Основная характерная черта этих хромосом — наличие значительного количества петель хроматина, большая часть которых содержит от 20 000 до 100 000 нуклеотидных пар. Как в хромосомах типа ламповых щеток, так и в политенных хромосомах наименее конденсированными являются области, наиболее активно синтезирующие РНК. Судя по чувствительности к ДНКазе, лишь 10% ДНК находится в относительно деконденсированном состоянии и транскрибируется. Такой «активный» хроматин имеет иные биохимические свойства, нежели те, которыми обладают более конденсированные участки.

9.3. Репликация хромосом

Перед каждым делением клетка должна синтезировать копии всех своих хромосом. Таким образом, делению клетки предшествует ее переход из состояния интерфазы (фазы G1) в фазу синтеза ДНК (S-фаза). В типичной клетке высших эукариот S-фаза длится 8 часов. После ее окончания каждая хромосома представлена двумя копиями, которые продолжают оставаться соединенными в области центромер до наступления М-фазы. (см. рис. 9-35). Для удвоения хромосомы необходима репликация ее ДНК и последующая сборка на этой молекуле хромосомных белков, образующих хроматин. В гл. 5 мы обсуждали ферменты, участвующие в репликации ДНК, и строение репликационной вилки, обеспечивающей синтез (см. рис. 5-39). Переход клетки в S-фазу будет рассмотрен в гл. 13 как часть более общей проблемы контроля клеточного цикла. В данном разделе мы изложим принципы механизма репликации эукариотической хромосомы, укажем время, необходимое для этого, и, кроме того, проанализируем взаимосвязь процесса репликации и структуры хромосомы.

9-18

9.3.1. В хромосомах высших эукариот сайты инициации репликации активируются группами [31]

Как отмечалось ранее, репликационные вилки возникают на бактериальной хромосоме в участках с определенной последовательностью ДНК, называемых точками начала репликации (сайтами инициации репликации) (см. разд. 5.3.9). В каждом таком сайте образуется две вилки, которые движутся в противоположных направлениях со скоростью около 500 нуклеотидов в секунду пока не закончится репликация всей кольцевой ДНК бактериальной хромосомы. Бактериальный геном столь мал, что эти две репликационные вилки могут его полностью удвоить менее, чем за 40 минут.

В начале 60-х гг. был разработан метод, позволяющий в общих чертах изучать репликацию хромосом эукариот. В культуру клеток человека на короткое время вводят радиоактивную метку (Н-тимидин), затем клетки мягко лизируют и ДНК дают расправиться на поверхности предметного стекла, покрытого фоточувствительной эмульсией; после чего радиоавтограф изучают в световом микроскопе. Реплицировавшаяся ДНК выявляется в виде цепочки гранул серебра. Этим методом можно определить как скорость, так и направление движения репликационной вилки (рис. 9-55). Исходя из скорости, с которой увеличивается длина треков реплицировавшейся ДНК эукариот при увеличении времени мечения, репликационные вилки у этих организмов перемещаются примерно на 50 нуклеотидов в секунду, т. е. в десять раз медленнее, чем у бактерий. Возможно, это связано с тем, что ДНК, упакованную в хромосому, реплицировать труднее.

134

Рис. 9-55. Схема эксперимента, позволяющего судить о характере перемещения в течение S-фазы. Вновь синтезированную ДНК в культуре клеток человека подвергали импульсному мечению [3Н]-тимидином. А. Клетки лизировали и ДНК растягивали на предметном стекле, которое затем покрывали светочувствительной эмульсией. Через несколько месяцев светочувствительный слой проявляли, при этом становился видимым ряд серебряных зерен вдоль радиоактивной ДНК. Б. Тот же эксперимент с последующей инкубацией в среде, не содержащей метку.

Синтезированная в этих условиях дополнительная ДНК характеризуется пониженным уровнем радиоактивности. Оказалось, что гранулы серебра в паре темных треков (Б) как бы расходятся в противоположных направлениях, что свидетельствует о продвижении вилки в разные стороны от точки начала репликации (см. рис. 5-49). ДНК на данном рисунке выделена цветом только для того, чтобы облегчить понимание радиоавтографа. В действительности немеченая ДНК в таких экспериментах не видна.

Согласно современным представлениям, средняя хромосома человека состоит из единственной молекулы ДНК, содержащей около 150 млн. пар нуклеотидов. Для репликации такой молекулы от начала до конца репликационной вилки, движущейся со скоростью 50 нуклеотидов в секунду, потребуется 0,02 х 150 х 106 = 3,0 х 106 с (около 800 ч). При анализе радиоавтографов выяснилось, однако, что по каждой эукариоти-ческой хромосоме движется одновременно много вилок. Более того, часто в одной и той же области ДНК обнаруживается много вилок, тогда как в других участках той же хромосомы их нет совсем. Дальнейшие более детальные эксперименты выявили следующее: 1) сайты инициации репликации обычно активируются группами по 20-80 сайтов (их называют репликационными единицами); 2) в ходе S-фазы, по-видимому, активируются всё новые решшкационные единицы, пока вся ДНК не будет реплицирована; 3) отдельные точки начала репликации внутри репликационной единицы отстоят друг от друга на расстояние от 30000 до 300000 нуклеотидных пар, следовательно, в среднем на одну петлю хроматина может приходиться одна такая точка; 4) у эукариот, как и у бактерий, образуется сразу пара репликационных вилок, а по мере их расхождения от сайта инициации репликации формируется репликацион-

Рис. 9-56. Особенности репликации ДНК в хромосомах эукариот. Точки начала репликации в большинстве клеток расположены на расстоянии от 30000 до 300000 нуклеотидных пар друг от друга. Полагают, что репликационные вилки останавливаются только при встрече с

аналогичной структурой, двигающейся в противоположном направлении или по достижении конца хромосомы. В результате вся ДНК оказывается реплицированной.

135

ный глазок. Остановка вилки происходит только при столкновении с репликационной вилкой, движущейся в противоположном направлении (или при достижении конца хромосомы). Таким образом, по каждой хромосоме может двигаться независимо друг от друга много реплика-ционных вилок, образующих две целые дочерние спирали ДНК (рис. 9-56).

9-19

9-21

9.3.2. Сайтами инициации репликации служат определенные последовательности ДНК [32]

У бактерий и ряда вирусов животных в роли сайтов инициации репликации (точек начала репликации) выступают вполне определенные последовательности ДНК. Можно предположить, что и у эукариот точками начала репликации служат конкретные последовательности ДНК. Наибольшим успехом завершились поиски таких участков у дрожжей Saсcharomyces cerevisiae. Для их обнаружения использовали клетки, дефектные по жизненно важному гену. Эти клетки могут расти на селективной среде лишь при условии, что они несут плазмиду, содержащую активную копию отсутствующего гена. Если бактериальную плазмиду, несущую жизненно важный ген переносят в дефектную клетку дрожжей, то плазмида не реплицируется, поскольку сайт инициации репликации бактерии в составе плазмидной ДНК не способен инициировать репликацию в клетке дрожжей. Однако если встроить в плазмиду (до ее переноса в клетки дрожжей) случайные фрагменты дрожжевой ДНК, то небольшая часть молекул плазмидной ДНК получит дрожжевой сайт инициации репликации и, следовательно, сможет реплицироваться. Клетки дрожжей, несущие такие плазмиды, способны расти, так как они получили жизненно важный ген (рис. 9-57). Последовательности ДНК дрожжей, присутствующие в плазмидах, которые выделены из этих клеток, названы автономно реплицирующимися

(autonomously replicating

Рис. 9-57. Метод выявления автономно реплицирующихся последовательностей (ARS-элементов) у дрожжей. Эти последовательности выступают в роли точек начала репликации, содержащие их плазмиды способны самостоятельно реплицироваться в хозяйской клетке, не включаясь в состав хромосом.

136

sequences, ARS). ARS-последовательности встречаются в геноме дрожжей примерно с той же частотой, которая постулируется для точек начала репликации (приблизительно одна на каждые 40000 нуклеотидных пар). Для функционирования ARS необходима консенсусная последовательность, состоящая из 11 нуклеотидов [(А или Т) ТТТАТ (А или G)TTT(A или Т)]. Искусственно сконструированный тандем, состоящий из таких последовательностей, при встраивании в плазмиду функционирует в дрожжевой клетке как ARS. Отсюда следует, что инициаторный белок, чтобы начать репликацию, должен узнать расположенные рядом друг с другом копии этой последовательности. Были сделаны попытки идентифицировать участки ДНК, которые в клетках высших эукариот выступают в роли сайтов инициации репликации, однако подобные последовательности еще недостаточно хорошо изучены.

9-20

9.3.3. Хромосома вируса SV40 реплицируется в бесклеточной системе млекопитающих [33]

В репликационных системах прокариот движение репликационной вилки обеспечивает комплекс, состоящий из нескольких ферментов: ДНК-полимеразы, ДНК-праймазы и ДНК-геликазы (см. разд. 5.3.6). Этот комплекс собирается в точке начала репликации в результате реакции с участием инициаторного белка, который специфически связывается с точкой начала репликации ДНК (см. рис. 5-50). Чтобы выявить все ферменты, участвующие в репликации ДНК млекопитающих, было предпринято много попыток реконструировать этот процесс in vitro. В наиболее удачных системах in vitro, разработанных до сих пор, удалось реплицировать небольшую кольцевую хромосому вируса обезьяны (SV40). Все белки, необходимые для его репликации (за исключением одного), обеспечиваются клеткой-хозяином. Исключение составляет Т-антиген SV40, большой многофункциональный белок (90000 дальтон), который позволяет этому вирусу избежать блокировки повторной репликации ДНК (см. разд. 9.3.11) и, таким образом, реплицироваться быстрее, чем ДНК клетки-хозяина. Множественные копии Т-антигена специфически связываются с точкой начала репликации SV40 и действуют одновременно и как инициаторный белок, и как ДНК-геликаза для того, чтобы раскрыть спираль ДНК в этом сайте. Затем к одной из цепей в этом участке присоединяется комплекс ДНК-полимеразы (ДНК-поли-мераза а) и ДНК-праймазы (оба фермента принадлежат клетке-хозяину). Образующаяся репликационная вилка напоминает репликационную вилку прокариот, но отличается от нее тем, что в ней функционируют два типа ДНК-полимераз: ДНК-полимераза а на отстающей цепи и ДНК-по-лимераза 5 на ведущей цепи. У прокариот же на обеих сторонах репликациониой вилки действуют разные молекулы одной и той же ДНК-полимеразы (см. разд. 5-47).

Белок, инициирующий репликацию на хромосомах эукариотических клеток, еще не обнаружен. Таким образом, остается неизвестным, действует ли этот белок подобно Т-антигену в качестве ДНК-геликазы или же, как у прокариот, инициаторные и геликазные функции берут на себя разные белки.

9.3.4. По мере репликации ДНК новые гистоны образуют хроматин [34]

Для образования нового хроматина в каждом клеточном цикле требуется огромное количество гистонов, масса которых примерно равна массе вновь синтезированной ДНК. В связи с этим у большинства

137

организмов для каждого из гистонов имеется много копий генов. Например, в клетках позвоночных обнаружено приблизигельно 20 одинаковых генных блоков, каждый из которых содержит все пять гистоновых генов.

В отличие от большинства клеточных белков, которые синтезируются во время интерфазы, гистоны образуются главным образом в S- фазе. За это время в результате усиления транскрипции и уменьшения распада гистоновой мРНК ее содержание в клетке увеличивается примерно в 5 раз. Вследствие необычного строения З'-конца (см. разд. 10.4.13) основные гистоновые мРНК чрезвычайно нестабильны и подвергаются распаду через несколько минут после окончания синтеза ДНК в конце S-фазы (или при добавлении ингибитора, прерывающего синтез ДНК). В противоположность этому сами молекулы гистонов очень стабильны и могут существовать в течение всей жизни клетки. Тесная связь между синтезом гистонов и синтезом ДНК может быть, по крайней мере отчасти, обусловлена механизмом обратной связи, который контролирует уровень свободных гистонов, чтобы обеспечить соответствие количества гистонов количеству вновь синтезированной ДНК.

После сборки нуклеосом молекулы гистонов редко либо вообще никогда не покидают ДНК, с которой они связаны. Следовательно, по мере своего продвижения решгакационная вилка должна преодолевать родительские нуклеосомы, которые, по-видимому, устроены так, чтобы не препятствовать ходу транскрипции и репликации. В соответствии с одной из гипотез каждая нуклеосома при репликации ДНК временно раскрывается с образованием двух «полунуклеосом», что дает возможность ДНК-полимеразе копировать развернувшуюся молекулу (рис. 9-58).

Вновь синтезированная ДНК, остающаяся позади регшикационной вилки, наследует старые гистоны, и кроме того, чтобы завершить

Рис. 9-58. Гипотетическая схема, показывающая, как нуклеосома может открываться для репликации ДНК и затем вновь собираться после прохождения репликационной вилки. При этом гистоны, входящие в состав нуклеосомы, остаются постоянно связанными с ДНК. На данном

рисунке старая нуклеосома наследуется в прежнем виде спиралью ДНК, образовавшейся на ведущей цепи, однако в действительности пока неизвестно, как она наследуется. Представлена лишь одна из многих возможных моделей.

138

упаковку в хроматин, требует такого же количества новых гистонов (см. рис. 9-58). Новые гистоны обычно связываются в первые несколько минут после прохождения репликационной вилки. Однако для полного формирования вновь образованному хроматину необходим целый час. Именно в этот период новые гистоны проявляют большую чувствительность к модифицирующим ферментам, чем старые гистоны. Неизвестно, чем отличается по своему химическому составу зрелый хроматин от незрелого; полагают, что для созревания необходимы как ковалентная модификация гистонов, так и изменения в способности связываться с другими белками, входящими в состав хроматина.

9-5

9.3.5. Теломеры состоят из коротких G-богатых повторов, которые добавляются к концам хромосом [35]

Как отмечалось выше, невозможность полностью реплицировать конец молекул линейных ДНК с помощью ДНК-полимеразы привела к появлению на концах эукариотических хромосом специфических последовательностей ДНК, названных теломерами (см. разд. 9.1.2). У таких разных организмов, как простейшие, грибы, растения и млекопитающие, эти участки имеют одинаковое строение. Они состоят из многих, расположенных друг за другом повторов одной короткой последовательности, которая содержит блок G-нуклеотидов (рис. 9-59, А). G-богатая теломерная последовательность всегда расположена на З'-конце молекулы ДНК и, по-видимому, складывается в специальную структуру, которая защищает конец хромосомы. Предполагаемый механизм репликации ДНК теломеры ресничного простейшего Tetrahymena приведен на рис. 9-59, Б.

9.3.6. Различные области одной и той же хромосомы в S-фазе реплицируются в разное время [36]

Учитывая скорость движения репликационной вилки и расстояние, отделяющее две соседние точки начала репликации, можно сделать вывод, что синтез ДНК на этом участке, по-видимому, в норме занимает около часа. Несмотря на это, S-фаза в клетках млекопитающих обычно длится примерно 8 часов. Отсюда следует, что не все точки начала репликации активируются одновременно, и время репликации каждой группы этих сайтов (20-80 сайтов) занимает лишь небольшую часть всей S-фазы.

Рис. 9-59. А. Повторяющиеся G-богатые последовательности, которые образуют теломеры различных эукариотических организмов. Б. Возможный путь образования тело-мер (по данным, полученным на Tetrahymena). На отстающей цепи матричной молекулы ДНК синтезируется

неполная цепь (см. рис. 5-39). При соединении с теломерой, теломераза Tetrahymena узнает структурную особенность G-богатой последовательности. Поскольку в качестве субстрата этот фермент использует нуклеозидтрифосфаты, нуклеотид на З'-конце должен сигнализировать теломеразе, какой нуклеотид G или Т присоединять на данной стадии. Реакции, сокращающие и удлиняющие последовательность теломеры, не совсем сбалансированы, в результате концы хромосом состоят из разного числа повторов (примерно сотни нуклеотидных пар).

139

Рис. 9-60- Световая микрофотография окрашенных митотических хромосом. Реплицирующуюся ДНК метили в предшествующей митозу S-фазе. Для этого клетки выращивали в присутствии синтетического нуклеозида 5'-бромдезоксиуридина (BrdU), а затем в течение коротких

промежутков времени метили ти-мидином в ранней, средней или поздней S-фазе. Поскольку у ДНК, синтезировавшейся в период пульс-мечения, одна из цепей несет тимидин, а другая BrdU, эти участки окрашиваются более интенсивно, чем остальная ДНК, у которой BrdU входит в состав обеих цепей. Пунктиром соединены соответствующие участки на трех копиях хромосомы. (С любезного разрешения Elton Stubblefield.)

Активируются ли различные единицы репликации случайным образом или же существует строгий порядок, согласно которому и удваиваются определенные области генома? Для того, чтобы ответить на этот вопрос, была проведена серия экспериментов. Синхронизированную клеточную культуру, находящуюся в S-фазе, в течение коротких промежутков времени метили аналогом тимидина 5-бромдезоксиуридином (BrdU). Области митотических хромосом, включившие метку в свою ДНК, можно обнаружить в М-фазе по снижению окрашивания определенным красителем или по связыванию со специфическими антителами. Такие опыты показали, что области хромосом реплицируются в виде больших единиц, а очередность их удвоения в S-фазе для каждой хромосомы строго регламентирована (рис. 9-60).

9.3.7. Высококонденсированный хроматин реплицируется в поздней S-фазе [37]

В клетках высших эукариот некоторые участки ДНК более конденсированы по сравнению с другими. Например, в интерфазе гетерохроматин остается в сильно конденсированном состоянии (которое сходно с кон-формацией хромосом в митозе), тогда как активный хроматин становится менее компактным, что, по-видимому, необходимо для синтеза РНК (см. разд. 10.3.11).

Для понимания механизма, определяющего момент репликации конкретного участка, очень важны данные о том, что гетерохроматиновый блок (включая околоцентромерные области), остающийся конденсированным в интерфазе, реплицируется в поздней S-фазе. По-видимому, поздняя репликация связана с упаковкой ДНК в хроматин. Такой вывод подтверждается хронометрированием репликации двух Х- хромосом в клетках самок млекопитающих. Известно, что эти две хромосомы содержат одинаковые последовательности ДНК, но одна из них активна, а другая нет (см. разд. 10.3.9). Почти все неактивные Х-хромосомы состоят из гетерохроматина и их ДНК реплицируется в поздней S-фазе; активная Х-хромосома менее конденсирована и реплицируется, как оказалось, в течение всей S-фазы. Напрашивается вывод, что менее конденсированный в интерфазе хроматин более доступен для реплика-ционной машины и состоящие из него области реплицируются в первую очередь.

С другой стороны, по данным радиоавтографии все репликационные вилки в течение S-фазы движутся со сравнимыми скоростями; таким образом, степень конденсации хромосом, вероятно, не влияет на работу этой вилки, если она уже образовалась. Однако порядок активации точек начала репликации, по-видимому, по крайней мере отчасти зависит от структуры хроматина данного участка.

9.3.8. Гены в составе активного хроматина реплицируются в ранней S-фазе [38]

Связь между строением хроматина и временем репликации ДНК подтверждается данными о времени репликации отдельных генов. Популяцию растущих клеток метили бромдезоксиуридином, после чего клетки тут же разделяли по размеру центрифугированием. Так как рост клеток связан с клеточным циклом, клетки большего размера окажутся «старше», и их ДНК, таким образом, будет помечена на более поздней стадии S-фазы. Из клеток каждого типа выделяли ДНК, меченную BrdU, и гибридизовали ее с серией известных ДНК-зондов, чтобы определить, какие гены она содержит. Поскольку ДНК, в состав которой входит BrdU, более плотная, ее легко можно отделить от обычной ДНК пу-

140

Рис. 9-61. Одна из моделей, объясняющих почему активный хроматин (выделен цветом} реплицируется в ранней S-фазе, а неактивный-в поздней S-фазе. Предполагают, что в точке начала репликации на активный и неактивный хроматин действуют различные инициаторные белки. Согласно другой гипотезе, два типа сайтов инициации репликации используют один и тот же молекулярный механизм, но в различное время,

просто потому, что конденсированная структура обычного хроматина затрудняет доступ необходимых для репликации белков.

тем центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия (см. разд. 4.4.1).

Таким образом, исследователи владеют эффективным методом, позволяющим определить время репликации любого гена, для которого имеется ДНК-зонд. Оказалось, что во всех изученных клетках гены «домашнего хозяйства» (т. е. те, которые активны во всех клетках) реплицируются в ранней S-фазе. Напротив, гены, активные в некоторых типах клеток, реплицируются рано лишь в тех клетках, где они активны, и позже в других типах клеток. Например, при изучении таким способом длинных последовательностей гена иммуноглобулина размером 300000 нуклеотидных пар оказалось, что в клетках, где этот ген активен, все области хроматина, в состав которого он входит, завершают свою репликацию

вначале S-фазы. Вероятно, это связано с существованием внутри гена нескольких точек начала репликации, активирующихся примерно в одно и то же время. Иная картина наблюдается в тех клетках, где синтез иммуноглобулина отсутствует. С помощью ДИК-зондов была выявлена единственная репликационная вилка, которая возникла на одном конце этого участка хромосомы примерно через час после начала S-фазы и затем двигалась вдоль ДНК с постоянной скоростью около 3000 нуклеотидов в минуту.

На рис. 9-61 представлена простая модель, объясняющая эти результаты. Согласно этой модели, все точки начала репликации, расположенные в активном хроматине, начинают работать в самом начале S-фазы. Затем репликационные вилки, возникшие на этих участках, обязательно передвинутся в соседние области хромосомы, где хроматин характеризуется более конденсированной структурой, поэтому любой ген, расположенный менее, чем за миллион нуклеотидных пар от точки начала репликации, будет реплицироваться в середине S-фазы. Чтобы стало понятным, как могут реплицироваться неактивные области хромосомы, расположенные далеко от активного хроматина, необходимо допустить, что

всередине или в поздней S-фазе активируется вторая группа точек начала репликации, которые могут инициировать возникновение репликационных вилок в хроматине, обладающем любой структурой.

9.3.9. Поздно реплицирующиеся участки совпадают с АТ-богатыми полосами на метафазных хромосомах [23]

Вероятно, многие репликационные единицы соответствуют различным сегментам хромосом, выявляемым с помощью специальных методов фиксации и окрашивания, которые используются для кариотипирования.