Литература БФХ / molekuljarnaja biologija kletki v2

181

зародыша дрозофилы. Набор регуляторных генов определяет последовательное подразделение эмбриона на отличающиеся друг от друга участки

(см. разд. 16.5.5).

10.1.6. Активность гена обычно зависит от действия нескольких регуляторных белков [5]

На первый взгляд схема комбинационной регуляции активности генов, представленная на рис. 10-7, дает основание для вывода о постепенно накапливающихся различиях между клетками последующих поколений. Например, можно предположить, что добавление регуляторного белка 2 к клеткам С и Е приведет к появлению в этих клетках одного и того же набора дополнительных белков (тех, которые кодируются генами, активируемыми белком-регулятором 2). Подобная точка зрения неверна по очень простой причине. Комбинационная регуляция гена гораздо сложнее этой схемы потому, что различные регуляторные белки взаимодействуют друг с другом. Даже у бактерий для включения одного-единственного гена иногда бывает необходимо взаимодействие двух различных регуляторных белков (см. разд. 10.2.2). У высших эукариот транскрипция какого-либо гена обычно требует совместного действия целого кластера активаторных белков (см. разд. 10.2.9). Например, белок 2 при взаимодействии с активаторным белком 1 может включать в клетке Е иной набор генов, нежели тот, который он включает в клетке С. По-видимому, именно поэтому единственный белок-рецептор стероидного гормона (пример белка-регулятора) в различных типах клеток млекопитающих определяет синтез разных наборов белка (см. разд. 12.2.2). В целом, специфические изменения в экспрессии гена, возникающие в результате синтеза регуляторного белка, зависят от предыстории клеток, так как именно эти предыдущие события и определяют, какие белкирегуляторы уже имеются в клетке (рис. 10-8).

10.1.7. Главные белки-регуляторы активируют сразу много генов [6]

Как отмечалось ранее, в клетке содержится много регуляторных белков, каждый из которых, действуя в комбинации с другими белками этого класса, контролирует многочисленные гены. Вероятно, существует разветвленная схема взаимодействий белков, согласно которой каждый

Рис. 10-8. Воздействие вновь синтезированных белков-регуляторов на клетку. Подобное воздействие зависит от того, какие белкирегуляторы уже имеются в клетке и, следовательно, от ее предыстории. На схеме один и тот же ген изображен в клетках А и В. Изначально этот ген

в обеих клетках выключен. Однако в клетке А продуцируется белок, изображенный крайним слева и отсутствующий в клетке В. Для простоты принимается, что каждый белок-регулятор либо положительно, либо отрицательно воздействует на транскрипцию, которая определяется их совместным воздействием. В действительности же общее воздействие не обязательно осуществляется по принципу аддитивности. Например, в некоторых случаях два белка-регулятора при связывании с ДНК взаимодействуют друг с другом, причем происходит изменение активности каждого из них.

Рис. 10-9. Схема, иллюстрирующая, как «решение» синтезировать один-единственный главный белок-регулятор может воздействовать на образование самых разных белков в клетке.

182

из регуляторных белков контролирует гены, кодирующие другие белки-регуляторы и так далее.

Однако не все регуляторные белки равны. Некоторые из них (главные белки-регуляторы) обладают решающим, координирующим действием на активность многих генов (рис. 10-9). Например, в гл. 16 будет показано, как ряд мутаций одного-единственного гена у Drosophila превращает одну часть тела мухи в другую. Мутации, вызывающие подобные изменения, известны под названием гомеотических (или гомеозисных). Одна из таких мутаций, названная Antennapedia, обусловливает синтез абберантного главного белка-регулятора. В результате целая группа клеток, в норме образующих антенну, коренным образом меняет свое поведение и формирует ногу; в итоге на свет появляется муха с растущей на голове ногой. О существовании главных регуляторных белков у позвоночных (включая человека) может свидетельствовать следующий факт. Отсутствие одного-единственного белка (рецептора стероидного гормона тестостерона) приводит к тому, что эмбрион с мужским генотипом (XY) развивается в фенотипически почти нормальную женщину (см. разд. 12.2.3). Прямое доказательство участия главных регуляторных белков в развитии позвоночных получено недавно при исследовании клеток скелетной мышцы.

10-5

10.1.8. Один-единственный главный белок-регулятор может превратить фибробласт в миобласт [7]

Клетка скелетной мышцы млекопитающих обычно очень велика и содержит много ядер. Она образуется в результате слияния многих клеток-предшественников, называемых миобластами (см. разд. 17.6.1). Зрелая мышечная клетка отличается от других клеток большим числом присущих только ей белков, включая специфические типы актина, миозина, тропомиозина и тропонина (входящих в состав сократительного аппарата), креатинфосфокиназу (обеспечивающую специализированный метаболизм мышечной клетки) и ацетилхолиновые рецепторы (необходимые для того, чтобы мембрана была чувствительна к нейростимуляции). В пролиферирующих миобластах такие специфичные для мышц белки и соответствующие им мРНК отсутствуют либо обнаруживаются в очень небольших количествах. По мере слияния миобластов в образующихся клетках одновременно увеличивается концентрация мышечно-специфичных белков и их мРНК. Следовательно, контроль за экспрессией соответствующих генов осуществляется на уровне транскрипции. Уровень синтеза многих специфичных для мышцы белков возрастает по меньшей мере в 500 раз. С помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле показано, что одновременно меняется концентрация многих других белков: некоторые из них перестают синтезироваться, продукция других достигает максимума и затем падает, у части белков происходит сдвиг с одного уровня синтеза на другой и так далее.

Если в культивируемые фибробласты кожи (клетки, которые в норме никогда не экспрессируют мышечно-специфичные гены) ввести ген регуляторного белка из миобласта (myo D1), такие клетки приобретают способность к слиянию и другие свойства мышечных клеток (рис. 10-10). Очевидно myo D1 является главным регуляторным белком, который в норме и определяет «миобласт».

Белок myo D1 сосредоточен в клеточном ядре. Исходя из нуклеотидной последовательности ДНК, была определена последовательность аминокислот в его молекуле. Изучение белка myo D1 показало, что он

Рис. 10-10. Иммунофлуоресцентная микрофотография фибробластов кожи куриного эмбриона, превратившихся в клетки мышц при экспрессии в них гена myoD1, которая была вызвана искусственным путем. Эти фибробласты выращивали в культуре и за три дня до съемки трансформировали рекомбинантной плазмидной ДНК. В состав этой плазмиды входили последовательности, кодирующие белок myoD, которые соединены с промотором/энхансером вирусного происхождения, активным в куриных эмбрионах. Несколько процентов фибробластов включало

ДНК и продуцировало белок myoD. Эти клетки слились с образованием удлиненных миофибрилл, которые на этой фотографии помечены антителами, выявляющими белок, специфичный для мышц. В контрольной культуре, трансфицированной другой плазмидой, мышечные клетки отсутствуют. (С любезного разрешения Stephen Tapscott, Andrew Lassar, Robert Davis и Harold Weintraub.)

183

связывается с регуляторними участками генов, специфичных для мышц. Свойства этого замечательного белка подтверждает предположение о том, что главные регуляторные белки способны детерминировать превращение клеток.

Заключение

У многоклеточных организмов дифференцировка клеток происходит в результате экспрессии разных генов одного и того же генома, хотя типы клеток на удивление мало отличаются друг от друга по содержанию белков. Экспрессия большинства генов контролируется на уровне транскрипции, что не исключает существенной роли посттранскрипционного контроля. Контроль на уровне транскрипции зависит от регуляторных белков, связывающихся с определенными последовательностями ДНК. В результате присоединения таких белков соответствующие гены либо включаются (позитивный контроль) либо выключаются (негативный контроль). Гены высших эукариот обычно регулируются путем комбинационного воздействия нескольких белков-регуляторов, осуществляющих позитивный и негативный контроль. Главные регуляторные белки играют в системе регуляции активности генов особую роль благодаря тому, что они влияют на активность сразу многих генов: например, экспрессия гена mуо D1 может превратить фибробласт в миобласт.

10.2. Контроль инициации транскрипции [8]

Всего лишь 40 лет назад мысль о том, что ген можно включать или выключать, казалась абсурдной. Гипотеза, сыгравшая такую важную роль в понимании работы клеток, была выдвинута на основании изучения Е. coli, растущей на смеси глюкозы и лактозы (дисахарид). Если бактерии предоставляли выбор источника углерода, она сначала использовала всю глюкозу и лишь затем начинала метаболизировать лактозу. Переключение на лактозу сопровождалось остановкой роста, в течение которой синтезировался фермент β-галактозидаза, гидролизирующий лактозу до глюкозы и галактозы. Выделение и характеристика мутантных бактерий, обладающих определенными дефектами в регуляции такого переключения, дало толчок биохимическим исследованиям, которые в 1966 г. привели к идентификации и выделению белка-penpeccopa лактозного оперона.

Врезультате биохимического и генетического изучения белка-репрессора лактозного оперона, репрессора бактериофага лямбда, а также других регуляторных белков у бактерий была сформулирована общая модель регуляции транскрипции у прокариот. Предполагалось, что сайтспецифические белки либо ингибируют, либо стимулируют транскрипцию какого-либо гена, присоединяясь к ДНК рядом с промотором-участком, с которого РНК-полимераза начинает синтез РНК. Считали, что изменение в положении таких регуляторных белков по отношению к ДНК (связывание или отсоединение) включает и выключает гены.

Втечение многих лет оставалось неизвестным, можно ли применять эту модель контроля генетической активности к клеткам эукариот. Известно, что ДНК эукариотической клетки упакована с помощью гистоновых белков в нуклеосомы, масса которых равна массе ДНК. Присутствие нуклеосом предполагает существование каких-то иных путей регуляции генов. Об этом же свидетельствует и тот факт, что у эукариот регуляторные белки часто связываются в участках, удаленных на тысячи нуклеотидных пар от промотора, на который они

184

действуют. Возможности изучения механизма регуляции генов эукариот были ограничены главным образом из-за того, что большинство белковрегуляторов присутствует в клетке в очень малых количествах (примерно один из 50000 молекул белка). Только в 1983 г. удалось охарактеризовать два необычно многочисленных (и, возможно, нетипичных) белка -регулятора - большой Т-антиген вируса SV40 и фактор транскрипции TF1IIA гена

5S-pPHK.

В последнее время ситуация в корне изменилась. Благодаря новым методам генной инженерии для биохимического и генетического анализа стало доступным большое число белков-регуляторов эукариот. Кроме того, у бактерий были выявлены белки-регуляторы, осуществляющие свое действие на расстоянии. Данный раздел посвящен тому общему, что объединяет механизмы регуляции транскрипции генов у прокариот и у эукариот. Процессы, которые могут оказаться характерными только для эукариот, мы обсудим позднее в связи с проблемой дифференцировки клеток (см. разд. 10.3.8).

10-8

10.2.1. Белки-репрессоры бактерий связываются вблизи промоторов и подавляют транскрипцию определенных

генов [9]

Хромосома Е, coli состоит из единственной кольцевой молекулы ДНК, насчитывающей ~ 4,7 х 10б нуклеотидных пар. В принципе такого количества достаточно для кодирования примерно 4000 различных белков, однако в конкретный момент времени в клетке синтезируется лишь определенная часть этих белков. Экспрессия многих генов E.coli зависит от внутриклеточного уровня специфических метаболитов.

Изучение генетического контроля утилизации лактозы в клетках Е. coli привело исследователей к выводу о существовании белкарепрессора, который в отсутствие лактозы в среде выключает синтез β-галактозидазы. Выделение, очистка этого белка и использование его в опытах in vitro позволили расшифровать механизм такой регуляции. Оказалось, что репрессор ингибирует транскрипцию lac-оперона, связываясь с так называемым оператором - последовательностью ДНК длиной 21 нуклеотид, которая перекрывается с расположенным по соседству участком связывания РНК-полимеразы (промотором). До тех пор, пока репрессор

Рис. 10-11. Схема дерепрессии у бактерий. Небольшая специфическая молекула связывается с белком-репрессором, в результате чего происходит изменение его конформации и отделение от ДНК, при этом расположенные рядом гены могут начать транскрибироваться. В случае примера, описанного в тексте, аллолактоза связывается с белком-репрессором лактозного оперона, в результате чего синтезируется единственный транскрипт РНК, кодирующий три белка, которые участвуют в метаболизме лактозы (β-галактозидаза, галакто-зидпермеаза и галактозидацетилаза). Поскольку три гена, кодирующие эти белки, расположены рядом друг с другом и их регуляция осуществляется строго координирование, кластер

этих генов называют лактозным опероном.

185

остается связанным с оператором, доступ РНК-полимеразы к ее участку связывания закрыт и транскрипция близлежащих областей ДНК не происходит (см. рис. 10-14).

Белок-реперессор лактозного оперона отвечает за то, чтобы уровень синтеза β-галактозидазы - фермента, необходимого для расщепления лактозы, соответствовал потребностям клетки. Лактозный репрессор в свою очередь находится под контролем небольшой углеводной молекулы аллолактозы, которая образуется в клетке в присутствии лактозы. Когда внутриклеточное содержание аллолактозы достигает достаточно высокого уровня, она, выполняя функцию аллостерического регулятора, индуцирует конформационные изменения в молекуле репрессора. При этом его связь с ДНК ослабляется настолько, что он отделяется от нее, освобождая промотор и давая возможность РНК-полимеразе транскрибировать прилежащие области ДНК. В этом случае говорят о дерепрессии гена. Такая система регуляции позволяет E.coli производить фермент, необходимый для расщепления лактозы, лишь тогда, когда это необходимо (рис. 10-11).

Внастоящее время известно много других примеров специфической репрессии бактериальных генов. В каждом случае связывание белкарепрессора с определенной последовательностью ДНК приводит к выключению гена. Процесс связывания всегда регулируется определенными сигнальными молекулами, аналогичными аллолактозе. Иногда, как в случае репрессора лактозного оперона, присутствие сигнальных молекул в клетке включает ген или единицу транскрипции, уменьшая сродство белка-репрессора к определенной последовательности ДНК. Но сигнальная молекула может использоваться и для выключения гена с помощью белка-репрессора. Например, аллостерическое изменение, вызванное связыванием сигнальной молекулы с репрессором, может повысить, а не понизить способность репрессора связываться с определенной последовательностью ДНК. Такой механизм действует в случае контроля активности пяти расположенных рядом генов, которые кодируют ферменты, необходимые для синтеза триптофана в клетках E.coli (trp-onepoн). Синтез единственной длинной молекулы мРНК, кодирующей эти пять белков, контролируется белком-репрессором, который «садится» на ДНК лишь в том случае, если он связан с триптофаном (сигнальная молекула, включающая этот оперон) (рис. 10-12).

Вслучае laс-оперона повышение концентрации сигнальных молекул

Рис. 10-12. Соединение триптофана с белком-репрессором триптофанового оперона изменяет конформацию репрессора. Конформационные изменения дают возможность этому регуляторному белку тесно связываться со специфической последовательностью ДНК, и, таким образом, блокировать транскрипцию генов, которые кодируют белки, участвующие в синтезе триптофана (trp-оперон). Трехмерная структура

этого бактериального белка (спираль-виток-спираль) определена с помощью метода рассеивания рентгеновских лучей и показана как в случае связывания триптофана, так и без него. Связывание триптофана приводит к увеличению расстояния между двумя узнающими спиралями (цветные цилиндры) в димере, что способствует образованию симметрично расположенных водородных связей, изображенных на схеме в виде цветных лучей. (По R. Zhang et al., Nature, 327: 591-597, 1987.)

186

Рис. 10-13. Обобщенная схема различных механизмов, с помощью которых специфические регуляторные белки контролируют транскрипцию генов у прокариот. А. Негативный контроль; Б. Позитивный контроль. Обратите внимание, что лиганд-индуктор может включить ген, либо обеспечивая удаление белка-репрессора (слева вверху), либо способствуя присоединению к ДНК белка-активитора (справа внизу). Аналогичным образом лиганд-ингибитор может выключить ген как путем удаления белка-активатора (справа вверху), так и путем связывания

белка-репрессора с ДНК (слева внизу).

способствует освобождению ДНК от репрессора и активации транскрипции, а в случае trp-оперона вызывает связывание репрессора с ДНК и, таким образом, подавляет транскрипцию. Следует, однако, подчеркнуть, что оба описанных механизма в принципе одинаковы: и в том, и в другом случае транскрипция осуществляется в отсутствие регуляторного белка. Генетический контроль такого типа называется негативной регуляцией (рис. 1013, А).

10-10

10.2.2. Бактериальный белок-активатор взаимодействует с РНК-полимеразой и способствует инициации транскрипции [10]

В случае негативной регуляции белок-рецептор связывается с участком, расположенным рядом с промотором, и подавляет активность РНК-полимеразы. Альтернативный способ регуляции генной активности основан на действии белков-активаторов, усиливающих активность РНКполимеразы. У Е. coli такая позитивная регуляция играет важную роль в активации транскрипционных единиц, обладающих относительно слабыми промоторами, которые сами по себе плохо связываются с полимеразой. Присоединение белка-активатора к специфической последовательности ДНК, расположенной недалеко от промотора, облегчает «посадку» РНК-полимеразы, что в конечном итоге приводит к повышению вероятности транскрипции.

Несмотря на разницу в действии белков-активаторов и белков-репрессоров, по многим свойствам они близки. Более того, оказалось, что определенные бактериальные белки-регуляторы способны функ-

187

Рис. 10-14. Концентрация глюкозы и лактозы контролирует инициацию транскрипции lаc-оперона путем воздействия на белок-репрессор лактозного оперона и САР. При добавлении лактозы происходит увеличение концентрации аллолактозы, которая удаляет белок-репрессор с ДНК

(см. рис. 10-11). Добавление глюкозы вызывает уменьшение концентрации сАМР, и поскольку сАМР больше не связывается с САР, этот активаторный белок отделяется от ДНК, выключая таким образом оперон. Связывающие сайты и белки изображены в масштабе. Как показано на схеме, полагают, что САР соприкасается с полимеразой, что помогает ей начать синтез РНК.

ционировать и как репрессоры, и как активаторы: они связываются с различными сайтами и в некоторых из них подавляют транскрипцию, а в других активируют. Активаторы, как и репрессоры, часто соединяются со специфическими сигнальными лигандами, которые либо повышают, либо понижают их сродство к ДНК, и таким путем, соответственно, включают или выключают гены. Такая регуляция транскрипционной активности генов носит название позитивной регуляции, поскольку эффективность синтеза РНК повышается в присутствии регуляторного белка (рис. 10-13, Б), Наиболее изученный пример белка-актива тора - белок-активатор катаболизма (САР) Е. coli. Этот белок позволяет бактерии использовать

альтернативные источники углерода, если глюкоза - основной его источник, отсутствует.

В случае lаc-оперона взаимодействие репрессора и САР-белка обусловливает характерную картину экспрессии гена. Как отмечалось выше, в присутствии лактозы аллолактоза разъединяет репрессор и ДНК. Однако этого оказывается недостаточно для активации транскрипции laсоперона, в связи с тем, что его промотор лишь отдаленно напоминает консенсусную последовательность промоторов Е. coli и, следовательно, обладает очень слабым сродством к РНК-полимеразе. Для транскрипции с этого промотора необходимо, чтобы его связывание с РНК-полимеразой было дополнено присоединением САР-белка на участке, расположенном прямо перед промотором (рис. 10-14). Такая же ситуация характерна для промоторов многих генов, участвующих в метаболизме Сахаров.

Связывание ДНК с САР регулируется глюкозой, это приводит к тому, что другие источники углерода используются клеткой только в отсутствие глюкозы. Недостаток глюкозы обусловливает повышение внутриклеточной концентрации сАМР, выполняющего роль сигнальной молекулы у бактерий и у эукариот. При связывании сАМР с САР-белком последний меняет свою конформацию, в результате чего приобретает способность присоединяться к определенной последовательности ДНК и активировать транскрипцию близлежащих генов. Если глюкозы много, уровень сАМР падает, его молекула отделяется от САР-белка,

188

который при этом превращается в неактивную форму, не способную более связываться с ДНК; в результате клетка переключается на утилизацию глюкозы (см. рис. 10-14).

10-9

10.2.3. Изменения в фосфорилировании белков могут влиять на активность генов [11]

Все ранние работы по белкам-репрессорам были выполнены на бактериях. Выяснилось, что и у лактозного, и у триптофанового оперона активность этих белков контролируется посредством обратимого связывания небольших специфических молекул. В клетках эукариот белкирегуляторы тоже находятся под контролем небольших сигнальных молекул, таких, например, как сАМР. Эти молекулы осуществляют свое воздействие непрямым путем, влияя на фосфорилирование и дефосфорилирование белка. Хотя у бактерий фосфорилирование не играет такой важной роли в регуляции, и у них существует одна хорошо изученная система контроля, зависящая от фосфорилирования белков. На примере этой системы мы рассмотрим некоторые аспекты регуляции генов, знание которых способствует пониманию более сложной системы регуляции высших эукариот.

Известно, что у бактерий родственные белки контролируют азотный и фосфатный обмен, синтез белков мембраны, хемотаксис и споруляцию. Здесь будет рассмотрен азотный обмен у Е. coli, в котором синтез ряда белков усиливается при нехватке азота. К таким белкам относится глутаминсинтетаза - фермент, играющий наиболее важную роль в усвоении азота и катализирующий реакцию: глутаминовая кислота + аммиак → глутамин.

В активации генов азотного обмена участвует два основных регуляторных компонента: белок ntrC, активирующий белок, способный включать гены лишь тогда, когда он фосфорилирован (ntrС-фосфат), и белок ntr В, который может либо фосфорилировать (благодаря своей киназной активности), либо дефосфорилировать (благодаря своей фосфатазной активности) белок ntrC. Фосфорилирование ntrC происходит в ходе реакций, запускающихся снижением уровня азота, при этом остатки уридинмонофосфата (UMP) присоединяются к регуляторной субъединице ntr В. Такая модификация повышает относительную киназную активность фермента ntr В.

Потребность в азоте определяется соотношением α-кетоглутарата и глутамина, повышение этого показателя стимулирует фосфорилирование ntr С и, таким образом индуцирует транскрипцию гена глутаминсинтетазы (рис. 10-15). Аналогичные цепочки реакций модификации белков происходят и в клетках эукариот, они тоже приводят к фосфорилированию или дефосфорилированию белков-регуляторов, хотя детали этого процесса изучены гораздо хуже.

Рис. 10-15. Часть регуляторного каскада, который при нехватке азота активирует гены, участвующие в метаболизме азота у бактерий. Белок Р II служит регуляторной субъединицей белка ntrB. Преимущество подобной многоступенчатой регуляции состоит в том, что она может вызывать значительные изменения в метаболизме в ответ на относительно небольшие изменения в содержании азота. Побочные ответвления этой цепи также обратимо модифицируют другие ферменты, контролируя их каталитическую активность в ответ на изменения концентрации азота.

189

Рис. 10-16. Регуляторная область бактериального гена глутамин-синтетазы. Глутамин-синтетаза катализирует реакцию глутаминовая кислота + аммиак → глутамин. Два ярко окрашенных на рисунке сайта связывают белок ntrC особенно сильно и необходимы для активации

транскрипции.

10-10

10.2.4. Гибкость ДНК позволяет регуляторным белкам, связывающимся с отдаленными участками, влиять на транскрипцию генов [11, 12]

Только что описанная двухкомпонентная регулирующая система у бактерий имеет много общего с системой контроля эукариотических генов. Дело в том, что в ДНК существует два сильных участка связывания для белка ntrC, которые расположены на расстоянии 100 или более нуклеотидных пар перед промотором гена глутаминсинтетазы (рис. 10-16). В фосфорилированной форме ntrC (ntrC-фосфат) связывается с ними, и эти два сайти эффективно стимулируют транскрипцию. Более того, стимуляция наблюдается, даже если эти участки «отодвинуть» (методами генетической инженерии) от промотора более чем на ТОО нуклеотидных пар.

Если в отношении прокариот такое «действие на расстоянии» нельзя назвать чем-то необычным, а отношении эукариот этот феномен следует признать широкораспространенным. У прокариот имеется надежное доказательство того, что белки, связавшиеся с отдаленными участками ДНК, действуют по преимуществу так же, как и белки, присоединенные к соседним областям. Например, белок nlrC усиливает способность РНКполимеразы связываться с промотором и образовывать открытый инициаторный комплекс (см. рис. 9-65). Разделяющая эти сайты ДНК формирует петлю, что позволяет белкам, связавшимся в отдаленных участках, взаимодействовать с полимеразой (рис. 10-17). Такое взаимодействие происходит довольно легко, поскольку ДНК действует как «ограничитель» и белок, связавшийся даже на расстоянии нескольких тысяч нуклеотидных пар, постоянно сталкивается с промотором (рис. 10-18).

10.2.5. Различные сигма-факторы позволяют бактериальной РНК-полимеразе узнавать разные промоторы [11, 13]

В гл. 9 шла речь о том, что у бактерий существует еще один тип контроля генной активности на уровне транскрипции. При обсуждении строения бактериальной РНК-полимеразы отмечалось, что одна из составляющих ее пяти основных полипептидных цепей-сигма (δ) фактор - функционирует как фактор инициации. Этот фактор отделяется от ДНК в гот момент, когда полимераза начинает синтез РНК (см. разд. 9.4.1). У бактерий консенсусная последовательность транскрибируемого промотора узнается основной формой РНК-полимеразы, содержащей субъединицу δ70. Однако существуют и минорные формы полимераз, в состав которых входят δ-субъединицы, узнающие другие последовательности промотора. Например, субъединица δ54 является продуктом гена ntrA и наряду с белками ntr В и ntr C необходима именно для

Рис. 10-17. Схема энхансерного воздействия белка ntrC на синтез РНК гена глутамин-синтетазы E. coli. Связываясь с расположенными перед геном последовательностями ДНК, этот регуляторный белок повышает скорость транскрипции РНК-полимеразой. Хотя белок присоединяется к этим сайтам даже когда он не фосфорилирован, лишь фосфорилированная форма (ntrC-фосфат) может активировать

транскрипцию. Вероятно, для функционирования белка необходимы контакты с полимеразой, которые увеличивают присущую этому ферменту способность раскручивать ДНК и образовывать открытый комплекс (см. рис. 9-65), как показано на рисунке (см. рис. 10-18).

190

Рис. 10-18. Присоединение двух белков к отдельным сайтам на двойной спирали ДНК может в значительной мере повысить вероятность их взаимодействия. А. Связывание белков с помощью петли ДНК размером 500 нуклеотидных пар повышает частоту их сталкивания.

Интенсивность цвета отражает вероятность того, что окрашенный белок будет располагаться в каждой из точек пространства, окружающего белок, обозначенный белым кружочком. Б. Гибкость ДНК такова, что обычная последовательность образует плавный изгиб под углом 90° (изогнутый виток) примерно один раз на каждые 200 нуклеотидных пар. Следовательно, если два белка разделены всего лишь 100 нуклеотидными парами, их контакты относительно ограничены. В таких случаях взаимодействие белков облегчается, если они расположены на одной и той же стороне спирали ДНК (содержащей 10 нуклеотидов на виток). В. Эффективность концентрации окрашенного белка в сайте связывания белого белка как функция разделяющего их расстояния. (С любезного разрешения Gregory Bellomy, по М.С. Mossing and M.T. Record, Science 233: 889-892, 1986.)

транскрипции гена глутаминсинтетазы. Вполне возможно, что изменения в окружающей среде могут включать специфический набор генов благодаря синтезу определенного сигма-фактора.

Как отличить фактор инициации РНК-полимеразы, например, δ54, влияющий на узнавание промотора, от белка-регулятора, такого например, как ntrC? Один из подходов к решению этой задачи основан на том, что δ-факторы прочно соединяются с РНК-полимеразой, но сами по себе не способны связаться с определенными последовательностями ДНК. В отличие от них белки-регуляторы связываются именно с ДНК, но не с РНК-полимеразой. Другой подход учитывает тот факт, что в определенный момент времени с молекулой РНК-полимеразы объединяется лишь одна σ-субъединица. Меняя соотношение известного σ-фактора, например σ70, и испытуемого белка в опытах по транскрипции in vitro, можно прийти к определенному выводу. Если σ70 подавляет транскрипцию пропорционально этому соотношению (кон-

Рис. 10-19. Механизм, посредством которого белки контролируют инициацию транскрипции РНК в бактериальных клетках. Белки могут воздействовать либо стимулируя, либо блокируя ряд стадий, необходимых для начала продуктивного синтеза РНК (см. рис. 9-65). Механизм (Г) был впервые открыт при изучении арабинозного оперона Е. coli. Он представляет собой комбинацию механизмов А и Б, и это единственный из

четырех механизмов, до сих пор не обсуждавшийся в тексте. Данный вариант будет разобран ниже на примере эукариот (см. рис. 10-27).