Литература БФХ / molekuljarnaja biologija kletki v2

101

9.1.6. Хромосомы содержат разнообразные белки, связанные с определенными последовательностями ДНК

Информация, хранящаяся в ДНК, организуется, реплицируется и считывается разнообразными белками, связывающимися с ДНК (ДНК-связанные белки). Некоторые из этих белков связываются по всей длине молекулы относительно неспецифически и участвуют в ее упаковке, не мешая при этом функционированию других белков. Эти упаковывающие белки будут обсуждены ниже (см. разд. 9.1.17). Другие белки объединяются с определенными короткими последовательностями ДНК, которые часто в ходе эволюции оказываются в различных геномах консервативными (см. рис. 10-34). Такие сайт-специфические ДНК-связывающие белки имеют самые разнообразные функции. Некоторые из них, вероятно, участвуют в сворачивании длинной молекулы ДНК с образованием различных доменов, другие способствуют инициации репликации ДНК; многие из них контролируют транскрипцию генов. Каждый тип клеток многоклеточного организма содержит разнообразную смесь таких регуляторних белков. Действуя совместно, они определяют характер экспрессии различных генов (см. разд. 10.2.8).

Контроль экспрессии генов обсуждается в гл. 10. Здесь мы рассмотрим только вопрос о том, каким образом белок связывается с ДНК. Все до сих пор описанные сайт-специфические ДНК-связывающие белки узнают свою последовательность с внешней стороны молекулы и ассоциируют с ДНК, не влияя на спаренные основания. Это оказывается возможным благодаря тому, что части каждой нуклеотидной пары расположены в двух отдельных «бороздках» - большой и малой (рис. 9-8, А). В большой бороздке каждая из четырех возможных пар (А-Т, Т-А, G-C или C-G) однозначно узнается по специфическому расположению выступающих атомов, малая бороздка менее информативна в этом

Рис. 9-8. Узнавание ДНК-связывающими белками определенных пар оснований в составе молекулы ДНК. А. Двойная спираль ДНК (В- форма): цветом выделены большая и малая бороздки. «Края» каждой пары оснований выступают в эти бороздки, что дает возможностъ ДНКсвязывающим белкам опознавать различные последовательности нуклеотидов, образуя с ними водородные связи. Предполагаемое взаимодействие аминокислоты и А-Т-пары схематически изображено на Б (вид вдоль оси спирали). Расположение водородных связей донорных и акцепторных групп в этой бороздке различно для каждого из четырех возможных сочетаний нуклеотидных пар. Необходимо отметить, что В-форма спирали

ДНК правозакручена (см. рис. 3-4). Сайт-специфические ДНК-связывающие белки могут узнавать последовательности длиной от 4 до 50 нуклеотидных пар.

102

отношении. Как будет показано ниже, аминокислоты в связывающемся участке сайт-специфического белка расположены таким образом, чтобы усилить электростатические и водородные связи, возникающие при взаимодействии белка и определенной последовательности ДНК. Как и ожидалось, большая часть водородных связей с нуклеотидными парами, по-видимому, приходится на большую бороздку. Схема взаимодействия между боковой аминокислотной цепью и одной парой оснований в этой бороздке представлена на рис. 9-8, Б.

10-3

10-12

9.1.7. Уменьшение подвижности в геле позволяет выявить сайт-специфические ДНК-связываюшие белки в экстрактах клеток [6]

Молекула ДНК обладает высоким отрицательным зарядом и, следовательно, в электрическом поле быстро движется к положительному электроду. При электрофорезе в полиакриламидном геле молекулы ДНК разделяются по размеру, так как меньшие молекулы легче и быстрее проходят через поры геля. Молекулы белка, связавшись с ДНК, вызывают уменьшение подвижности ее молекул в геле. Чем больше связавшийся белок, тем медленнее движется связанная с ним ДНК. Это явление лежит в основе метода, регистрирующего сдвиг подвижности в теле. С помощью этого метода удается обнаруживать даже следовые количества сайт-специфического ДНК-связывающего белка. Короткие фрагменты ДНК, длина и последовательность которых известна (полученные либо при клонировании ДНК, либо путем химического синтеза), метят радиоактивной меткой и смешивают с экстрактом клеток; полученную смесь наносят на полиакриламидный гель и проводят электрофорез. Если фрагмент ДНК соответствует области хромосомы, с которой связываются многие сайт-специфические белки, то при радиоавтографии выявляется серия полос, обладающих разной подвижностью. Белки, связанные с ДНК в каждой из полос геля, можно отделить, фракционируя затем клеточные экстракты (рис. 9-9).

Рис. 9-9. Замедление в геле. Принцип метода схематически изображен на рис. 9-9, А. Экстракт, полученный из линии клеток, продуцирующих антитела, смешивают с радиоактивными фрагментами ДНК, содержащими последовательность от точки —131 до + 36 (относительно сайта инициации транскрипции в положении + 1) гена, кодирующего легкую цепь соответствующей молекулы антитела.

Воздействие белков, входящих в состав экстракта, на подвижность фрагмента ДНК определяют методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей радиоавтографией. Свободные фрагменты ДНК быстро передвигаются к концу геля, тогда как фрагменты, связанные с белком, задерживаются. Обнаружение шести зон с замедленным движением указывает на присутствие в экстракте шести различных сайт-специфических ДНК-связывающих белков (обозначенных С1-С6). На схеме Б экстракты фракционировали с помощью стандартной хроматографической методики, каждую фракцию смешивали с радиоактивным фрагментом ДНК, наносили на одну дорожку полиакриламидного геля и анализировали далее, как указано на схеме А. (Б-с изменениями из С. Scheidereit, A. Heguy, R.G. Roeder, Cell 51: 783-793, 1987.)

103

9.1.8. Сайт-специфические ДНК-связывающие белки можно выделить и охарактеризовать, используя их сродство к

ДНК [7]

Впервые сайт-специфические белки, связывающиеся с ДНК, были обнаружены у бактерий. С помощью генетического анализа у этих микроорганизмов удалось доказать существование регуляторных белков, таких как репрессор lac-оперона, репрессор бактериофага лямбда и сгобелок. Эти белки были выделены при последовательном фракционировании клеточных экстрактов на хроматографических колонках, а специфически связывающие их участки ДНК определены методом футприн-тинга (см. разд. 4.6.6). Аналогичными методами были выделены и охарактеризованы первые сайт-специфические ДНК-связывающие белки у эукариот: Т-антиген вируса SV40, фактор транскрипции TF11IA и рецептор стероидного гормона.

В настоящее время для выделения сайт-специфических ДНК-связывающих белков разработаны гораздо более совершенные методы. Процедура обычно начинается с определения сдвига подвижности в геле. Благодаря этому можно выяснить, с каким именно участком на фрагменте ДНК связывается неизвестный белок в клеточном экстракте (см. рис. 9-9). Затем химическим способом синтезируется соответствующий этому связывающему участку двухцепочечный олигонуклеотид, который можно использовать двумя способами. При аффинной хроматографии олигонуклеотид связывают с нерастворимым пористым носителем, например агарозой, а затем таким нагруженным носителем заполняют колонку, которая селективно связывает белки, узнающие определенные последовательности ДНК. Этот относительно нетрудоемкий метод позволяет добиться 10000-кратной очистки.

Большинство белков, связывающихся с определенной последовательностью ДНК, присутствуют в клетках высших эукариот в количестве нескольких тысяч копий на клетку (что соответствует примерно одной молекуле из 50000 молекул всех белков клетки). Этого количества оказывается достаточно, чтобы методом аффинной хроматографии выделить белок той степени чистоты, которая позволяет определять у него аминоконцевую последовательность аминокислот. Это дает возможность синтезировать олигонуклеотидный зонд и с его помощью идентифицировать соответствующий клон кДНК. Имея в руках нужный клон кДНК, исследователь может определить полную аминокислотную последовательность белка и получать его в неограниченных количествах. В некоторых случаях клон кДНК, кодирующий сайт-специфический ДНКсвязывающий белок, легче получить более простым путем, используя второй метод, еще более эффективный, чем аффинная хроматография ДНК. Этот метод начинается с получения библиотеки кДНК в соответствующим образом подобранном векторе. Отдельная колония бактерий (если экспрессирующий вектор - плазмида) или негативная колония (если вектор-бактериофаг) будет продуцировать большое количество белка, закодированного в содержащейся в ней кДНК. Чтобы найти ту редкую колонию, которая образует нужный белок, олигонуклеотид, содержащий соответствующий сайт связывания, метят радиоактивной меткой и используют его в качестве зонда на бумаге, куда нанесены аликвоты отдельных колоний (см. разд. 5.6.5). Те немногие колонии, которые синтезируют белки, специфически связывающие меченый олигонуклеотид, выращивают отдельно и испытывают дальше, чтобы найти среди них ту единственную, продуцирующую искомый белок.

Этот высоко эффективный метод разработан сравнительно недавно и поэтому на сегодняшний день из многих сотен сайт-специфических ДНК-связывающих белков, которые, как полагают, присутствуют в клетках высших эукариот, удалось выделить лишь небольшую часть.

104

9.1.9. Многие сайт-специфические ДНК-связывающие белки имеют одинаковые области [8]

Фактор транскрипции III A (TFIIIA) эукариот необходим для инициации синтеза небольших рибосомных РНК (5S-pPHK); он связывается в виде мономера с последовательностью ДНК размером около 50 нуклеотид-ных пар, расположенной почти в середине очень маленького гена 5S-pPHK. Аминокислотная последовательность этого белка дает основание предполагать, что он организован в виде серии девяти повторяющихся доменов, каждый из которых содержит по 30 аминокислот, сложенных в одну структурную единицу вокруг атома Zn, связывающего два остатка цистеина и два-гистидина. Другие белки, предположительно участвующие в регуляции генов, содержат меньшее число доменов со сходной структурой. Такие домены обычно называют «цинковыми пальцами». Белки, их содержащие, функционируют на ранних стадиях развития дрозофилы, более пяти таких белков участвуют в процессе скрещивания дрожжей; к этому же классу относится обычный фактор транскрипции млекопитающих Spl (см. разд. 10.2.8) и большая группа белков-рецепторов стероидного гормона (см. рис. 10-25).

Пока не определена трехмерная структура белков этого типа, и, следовательно, остается неизвестным, как они связываются с ДНК. На рис. 9-10 представлена гипотетическая схема, которую подтверждают данные футпринтинга.

9.1.10. Симметричные димеры ДНК-связывающих белков часто узнают симметричные последовательности нуклеотидов [8]

Для определения трехмерной структуры белка обычно необходим дифракционный рентгеноструктурный анализ больших кристаллов, получение которых часто представляет собой нелегкую задачу. Один из первых регуляторных белков, изученных таким методом - сго-белок бактериофага лямбда. Это небольшой белок (66 аминокислотных остатков), который не имеет «цинковых пальцев», однако, связывается с кластером специфических последовательностей ДНК, каждая из которых содержит

Рис. 9-10. Семейство сайт-специфических ДНК-связывающих белков типа «цинковые пальцы» А. Упрощенная схема строения ДНК- связы-вающего домена; кружочками обозначены отдельные аминокислоты. В настоящее время считается, что полипептидная цепь, образующая каждый «палец», имеет сложную глобулярную структуру. Б. Схема взаимодействия четырех «цинковых пальцев» с последовательностью ДНК. Согласно этой модели, каждый палец узнает определенную последовательность, состоящую примерно из пяти нуклеотидных пар. (С изменениями

из A. Klug, D. Rhodes, Trends in Biochem. Sci. 12: 464-469, 1987.)

105

Рис. 9-11. Специфическая последовательность ДНК, узнаваемая сrо-белком бактериофага лямбда. Выделенные цветом нуклеотиды в этой последовательности расположены симметрично, что позволяет половине димерного белка распознавать каждую половину данного сайта.

по 17 нуклеотидных пар. Одна из этих последовательностей приведена на рис. 9-11. Выделенная цветом часть последовательности является симметричной, т.е. при повороте спирали ДНК на 180° она не изменится. Симметрией обладают и многие участки связывания сайт-специфических белков. Такую симметрию можно объяснить исходя из структуры сrо-белка, определенной методом дифракции рентгеновских лучей.

Сrо-белок представляет собой симметричный гомодимер, который связывается с ДНК способом, изображенным на рис. 9-12. В связи с тем, что ось симметрии второго порядка последовательности белка расположена на оси симметрии второго порядка последовательности ДНК, каждая из одинаковых половин димера может образовывать одинаковые связи с теми нуклеотидными парами ДНК, которые она узнает. Во всех случаях, когда последовательность связывающего сайта ДНК симметрична, белок, узнающий ее, скорее всего оказывается димером или симметричным образованием большего размера.

9.1.11. Сrо-белок принадлежит к семейству ДНК-связывающих белков, построенных по принципу «спираль-виток- спираль» [9]

Сайт мономера белка его, контактирующий с ДНК, образован последовательностью из 20 аминокислот, формирующих две α-спирали, которые разделены коротким витком. Такой фрагмент спираль-виток-спираль обнаружен и у ряда других бактериальных сайт-специфических ДНК-свя-зывйющих белков, трехмерные структуры которых известны (рис. 9-13). Более того, анализ аминокислотных последовательностей (обнаруженная при этом гомология) свидетельствует о том, что такой фрагмент присутствует и в составе других белков, участвующих в регуляции активности генов у бактерий, дрожжей и дрозофилы.

Все белки, содержащие структуру спираль-виток-спираль, изображенные на рис. 9-13, представляют собой симметричные гомодимеры. Одна из α-спиралей в каждом мономере, называемая узнающей, располагается в большой бороздке, где выступающая часть ее аминокислотной последовательности образует водородные связи с определенными основаниями ДНК. Важно, что две идентичные узнающие спирали в димере разделены только одним витком цепи ДНК (3,4 нм). Такое разделение дает возможность каждой узнающей спирали одинаковым образом взаимодействовать с симметрично расположенными парами оснований в участке связывания (рис. 9-14).

Рис. 9-12. Схема связывания сrо-белка бактериофага лямбда с ДНК. Белок представляет собой симметричный гомодимер, который связывается с симметричной последовательностью ДНК, представленной на рис. 9-11. Способ связывания с ДНК определен путем анализа молекулярных моделей. А. Проволочная модель молекулы белка, совмещенная со схематическим изображением двойной спирали ДНК. Б.

Пространственная модель ДНК-белкового комплекса, показанного на А. На этой модели каждая аминокислота в белковой цепи изображена в виде сферы; цветные шары представляют остов ДНК. (С любезного разрешения Brian W. Matthews по W. F. Ander-son, D. H. Ohlendorf, Y. Takoda and B.

W. Matthews, Nature 290: 754-758, 1981, © 1981, Macmillan Journals Ltd.)

106

Рис. 9-13. Семейство димерных ДНК-связывающих белков. Эти регуляторные белки работают в бактериальных системах: репрессор лямбда и cro-белок контролируют экспрессию генов бактериофага лямбда, а белок активатор катаболизма (САР) регулирует экспрессию ряда генов

Е. coli, которые могут включаться лишь в отсутствие глюкозы. В каждом случае рентге-ноструктурный анализ выявил наличие двух копий узнающей спирали (коричневый цилиндр), разделенных одним витком спирали ДНК (3,4 нм).

Рис. 9-14. Спаривание боковой цепи аминокислот с парами оснований ДНК при узнавании нуклеотидной последовательности регуляторним белком-репрессором, влияющим на активность гена бактериофага 434. Комплекс ДНК с этим белком изучали методом

рентгеноструктурного анализа. (С изменениями из J. Е. Anderson, M. Ptashne and S.C. Harrison, Nature 326: 846-852, 1987.)

Молекула аллостерического эффектора, связываемая белком такого типа, может значительно повышать или снижать его сродство с ДНК, меняя расстояние между двумя узнающими спиралями. Аналогичным образом аллостерические эффекторы могут изменять сродство с ДНК других типов белков, регулирующих активность генов. Подобные изменения имеют большое значение при включении и выключении генов в ответ на изменения в окружающей среде (см. разд. 10.2.10).

9.1.12. Молекулы белков при связывании с ДНК частоконкурируют или кооперируются друг с другом [10]

Большинство генетических процессов зависит от взаимодействия между молекулами белков, которые одновременно связываются с близлежащими сайтами ДНК. В простейшем случае два сайт-специфических белка, участки связывания которых частично или полностью перекрываются, конкурируют друг с другом за место на спирали ДНК (рис. 9-15, А). Например, белок-репрессор может подавлять транскрипцию гена, блокируя связывание активирующего белка с ДНК. Однако белки могут и помогать друг другу более прочно удерживаться на ДНК. Такое кооперативное связывание может происходить как между двумя различными молекулами белка (рис, 9-15, Б), так и между двумя копиями молекул одного типа. В последнем случае белки, как правило, связываются по типу «все или ничего» и образуют на ДНК кластеры. При повышении концентрации этих белков, их связывание с ДНК резко возрастает (рис. 9-15, В). В качестве примера кооперативно связывающихся белков такого типа можно привести спираль-дестабилизируюгций белок, белок гесА (гл. 5) и гистон H1.

Механизм взаимодействия при кооперативном и конкурентном связывании на примере двух различных сайт-специфических ДНКсвязывающих белков будет обсуждаться дальше в связи с проблемой регуляции транскрипции (гл. 10).

9.1.13. Геометрия спирали ДНК зависит от последовательности нуклеотидов [11]

В течение 20 лет после открытия двойной цепи ДНК в 1953 г. полагали, что эта молекула имеет одинаковую структуру на всем своем протяжении, причем поворот спирали между соседними парами оснований составляет точно 36° (10 нуклеотидных пар на поворот спирали). Последующие эксперименты выявили, что ДНК гораздо более полиморфна, а варианты ее формы определяются последовательностью

107

Рис. 9-15. Примеры конкурентного и кооперативного взаимодействия при связывании белков с ДНК. А. Конкуренция происходит, когда связывание белков X и Y со специфическими сайтами ДНК взаимно исключается. Б. Кооперация имеет место, если связывание одного белка с ДНК

повышает сродство другого белка к близлежащему сайту. В. Самокооперативность приводит к связыванию отдельного белка в виде кластера молекул, в результате связывание с какой-либо областью ДНК происходит по типу «все или ничего».

Рис. 9-16. Три формы спирали ДНК, каждая из которых содержит 22 нуклеотидные пары. Все эти структуры образованы двумя антипараллельными цепями ДНК, которые удерживаются вместе благодаря спариванию комплементарных нуклеотидов. Каждая форма показана сбоку и сверху. Сахарно-фосфатный остов и пары оснований выделены разными оттенками серого: темно-серым и светло-серым, соответственно. А.

В-форма ДНК, которая чаще всего встречается в клетках. Б. А-форма ДНК, которая становится преобладающей при высушивании любой ДНК, независимо от ее последовательности. В. Z-форма ДНК: такую форму приобретают некоторые последовательности при определенных условиях. В- форма и А-форма-правоза-крученные, а Z-форма -левозакру-ченная (см. рис. 3-4). (С любезного разрешения Richard Feldmann.)

108

нуклеотидов. Форма спирали оказывает значительное влияние на ее взаимодействие с белками.

Существует несколько типов спирали ДНК, причем в некоторых случаях изменения в ее структуре оказываются весьма значительными. Самая стабильная форма ДНК - это правозакрученная спираль В-формы (рис. 9-16, А). Изучение рассеяния рентгеновских лучей показало, что небольшие области последовательности образуют правозакрученную спираль, отличающуюся от В-формы и известную как А-форма ДНК. Для этой формы характерен более сильный наклон оснований, в результате чего спираль оказывается более короткой и более широкой, чем в случае В- формы (рис. 9-16, Б). Вероятно, в некоторых случаях это имеет большое значение, например, когда нить ДНК спаривается с РНК в затравочной части фрагментов Оказаки (дополнительная гидроксиль-ная группа рибозы не позволяет спирали РНК-ДНК образовывать В-форму). По тем же причинам А-форму имеет и спираль РНК-РНК. А-форма характерна для спиральных областей шпилечных структур всех одноцепочечных РНК и, следовательно, чрезвычайно важна для жизнедеятельности клетки. Биологическая роль третьей спиральной формы ДНК менее ясна. Последовательности ДНК, состоящие из чередующихся пуринов и пиримидинов (GCGCGCGC) легко образуют левозакручен-ную двойную спираль, известную как Z-форма ДНК (рис. 9-16, В). Считается, что короткие области с такой структурой редко встречаются в хромосоме. Можно предположить, однако, что они особым образом распознаются белками, а значит, тоже способны играть существенную роль в жизнедеятельности клетки.

А- и Z-формы ДНК, которые сильно отличаются от стабильной В-структуры, весьма редки, но менее сильные изменения В-цепи являются обычными, и, несомненно, имеют важное биологическое значение. У нуклеиновых кислот, находящихся в В-форме, наклон оснований и угол поворота спирали между их парами существенно зависят от того, какие именно нуклеотиды соседствуют друг с другом в последовательности. В результате атомы спирали отклоняются от идеального положения. Даже ДНК-связывающие белки, которые не обладают способностью специфически узнавать определенные нуклеотидные пары, могут «чувствовать» такие искажения.

Значение вариаций в структуре ДНК-спирали для связывания сайт-cпецифических белков четко показано на примере репрессора

бактерио-

Рис. 9-17. Сравнение конформации ДНК в составе комплекса с репрессором бактериофага 434 (справа) с идеальной спиралью В-формы (слева). Фосфаты ДНК, контактирующие с белком, обозначены цветными кружочками. Углы, образующиеся при повороте спирали между парами оснований, указаны для искаженной спирали. Считается, что отклонения от идеальной спирали необходимы для более тесного связывания белка. Энергия связывания частично зависит от «неспецифического» взаимодействия между NH-группами и фосфатами ДНК. Такие, способствующие связыванию контакты, может образовывать лишь несколько искаженная спираль В-формы: середина малой бороздки в области связывающего сайта

должна быть слегка сужена, и спираль немного изогнута. Поскольку для получения такого изгиба и уплотнения спирали в центральной области должны присутствовать АТ-пары, их замена на GC значительно ослабляет связывание белков. Таким образом, пары оснований, расположенные в центре, узнаются репрессором даже если белок не контактирует непосредственно с этими основаниями (см. также рис. 9-14). (С изменениями из J.E.

Anderson, M. Ptashne and S.C Harrison, Nature 326: 846-852, 1987.)

109

Рис. 9-18. Электронная микрофотография фрагментов, несущих сильно изогнутый сегмент спирали ДНК. Фрагменты ДНК, выделенные из миниколец кинетопластов трипаносоми Crithidia fasciculata содержит всего лишь 200 пар нуклеотидов, однако некоторые из них изогнуты так, что весь фрагмент замыкается в кольцо. Нормальная спираль ДНК такой длины может при изгибе образовать в среднем лишь четверть кольца (один

равномерный правый виток). (По J. Griffith, М. Bleyman, С. A. Rauch, P. A. Kitchin and P. T. Englund, Cell 46: 717-724, 1986.)

фага X. С помощью рентгеноструктурного анализа установлено, что ДНК при связывании с этим белком приближается к идеальной В-форме (рис. 9.17).

9-7

9.1.14. Некоторые последовательности ДНК сильно изогнуты [12]

Спираль ДНК обладает достаточной конформационной свободой, чтобы выдерживать пружинящие изгибы и вращательные движения. Однако в связи с тем, что эта спираль обладает и жесткостью, для того чтобы она могла изогнуться под углом 90°, в молекуле ДНК должно содержаться приблизительно 200 нуклеотидных пар. Некоторые последовательности ДНК оказываются необычайно гибкими и намного легче остальных принимают изогнутую форму.

Есть последовательности ДНК, которые склонны всегда оставаться изогнутыми. К числу последних принадлежат последовательности, в которых через каждые 10-11 нуклеотидов встречаются повторы AAAAANNNNN (где N-любой нуклеотид) (рис. 9-18). Сильный изгиб таких молекул представляет собой крайнюю форму вариаций структуры спирали. Еще не ясно, обусловлен ли такой изгиб суммарным вкладом небольших наклонов между определенными парами оснований, большим изгибом в месте соединения коротких областей или же обоими типами воздействий.

Даже если специфические последовательности, влияющие на изгиб спирали, отсутствуют, структуру ДНК в значительной мере может исказить связывание белков, принимающих участие в формировании высококонденсированных комплексов белка и ДНК.

9.1.15. Белки могут сворачивать ДНК в плотную спираль [13]

Многие белки при связывании с ДНК изгибают ее, а если подобных ДНК-белковых связей много, то нить ДНК может сформировать плотную спираль вокруг белкового комплекса с образованием нуклеопротеиновой частицы. Известно, что у бактерий такие нуклеопротеиновые частицы образуются при связывании инициаторных белков с точкой начала репликации (см. разд. 5.3.9), а также при связывании ДНК с интегразой фага лямбда для катализа сайт-специфической рекомбинации (рис. 9-19). По-видимому, в таком сложном трехмерном соединении участвуют как конкурентное, так и кооперативное взаимодействия. Аналогичные типы взаимодействий используются при регуляции каталитической активности нуклеопротеиновых частиц, как показано на примере белкового комплекса, содержащего интегразу фага лямбда (рис. 9-20). В связи с тем, что при экспрессии эукариотических генов происходит связывание кластеров белков, регулирующих активность генов,

Рис. 9-19. Схема комплекса ДНК—белок, образуемого интегразой фага лямбда, ферментом, осуществляющим встраивание ДНК бактериофага в хозяйскую хромосому Е. coli. Этот комплекс катализирует сайт-специфическую рекомбинацию, разрывая и воссоединяя спирали ДНК бактериофага лямбда и бактерии по определенным участкам, называемым сайтами прикрепления (см. рис. 5-66). (С изменениями по Е. Richet,

P. Abcarian, Н.А. Nash, Cell 52: 9-17, 1988.)

110

Рис. 9-20. Исключение бактериофага лямбда из хромосомы бактерии контролируется посредством кооперативного и конкурентного взаимодействия между сайт-специфическими ДНК-связывающими белками. Реакция катализируется интегразой фага лямбда и является противоположной по своему действию сайт-специфической рекомбинации, показанной на рис. 9-19. А. Общая схема реакции и некоторые

участвующие в ней сайты связывания белков (указаны не все сайты). Для исключения необходимы разрыв и воссоединение двойной спирали ДНК в сайтах рекомбинации 1 и 2; при этом образуется кольцевая хромосома фага лямбда. Int-интеграза фага лямбда, Xis-эксцизионаза фага лямбда, a IHF и FIS -белки, образуемые бактериальной клеткой-хозяином. Б. Активация исключения белком FIS; указанные стадии, по-видимому, имеют место при низких концентрациях белков Int и Xis. Как показано, ряд белков при связывании сильно изгибают ДНК. Хотя белок Int катализирует реакцию сайт-специфической рекомбинации, его активность катализируется другими белками. (С любезного разрешения Arthur Landy.)

с определенными регуляторными последовательностями ДНК, аналогичные белковые комплексы могут принимать участие в контроле транскрипции ДНК и у эукариот (см. рис. 10-23).

Очевидно, что любые комплексы, имеющие отношение к регуляции определенных генов, должны встречаться относительно редко. В структуре хромосом эукариот присутствует главным образом другой тип нуклеопротеиновых частиц; речь идет о нуклеосоме, которая играет ведущую роль в упаковке и организации ДНК в клеточном ядре.

9.1.16. Гистоны - основные структурные белки хромосом эукариот [14]

Наиболее изученные структурные белки хромосом - это несомненно гистоны, которые имеются только в эукариотическвх клетках. Количество их в клетках столь велико, что у эукариот принято делить белки, связывающиеся с ДНК, на два класса: гистоны и негистоновые белки хромосом. Комплекс обоих классов белков с ядерной ДНК клеток эукариот известен под названием хроматин. Гистоны присутствуют в таких огромных количествах (около 60 млн. молекул каждого типа на клетку по сравнению с 10000 на клетку для типичного сайт-специфического белка), что их общая масса в хромосоме примерно равна содержанию ДНК.

Гистоны представляют собой относительно небольшие белки с очень