Литература БФХ / molekuljarnaja biologija kletki v3

231

Рис. 18-16. Фрагменты, образующиеся при расщеплении молекул антител протеолитическими ферментами папаином и пепсином.

фрагментов не обладает другими биологическими свойствами нативных молекул антител, так как не содержит «хвостовой» (Fc) области, ответственной за эти свойства.

18.2.5. Существуют пять классов Н-цепей, каждый со своими особыми биологическими свойствами [11, 15]

У высших позвоночных существуют пять классов антител - IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, каждый со своим классом Н-цепей α, δ, ε, γ и µ, соответственно. Молекулы IgA содержат α -цепи, молекулы IgG- γ-цепи и т.д. (табл. 18-1). Кроме того, имеется ряд подклассов иммуноглобулинов IgG и IgA; например, у человека существует четыре подкласса IgG (IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4), содержащих тяжелые цепи γ1, γ2, γ3 и γ4 соответственно. Разные Н-цепи придают шарнирным участкам и «хвостовым» областям антител различную конформацию и определяют характерные свойства каждого класса и подкласса (см. табл. 18-1).

IgM-это всегда первые антитела, продуцируемые развивающимися В-клетками, хотя многие В-клетки со временем переключаются на выработку антител других классов (разд. 18.4.7). Непосредственный предшественник В-клетки, так называемая пре-В-клетка, вначале вырабатывает только µ -цепи и накапливает их. Позднее в клетке начинают синтезироваться и легкие цепи; они соединяются с µ -цепями, образуя с ними четырехцепочечные молекулы IgM (каждая с двумя µ -цепями и двумя легкими цепями), которые встраиваются в плазматическую мембрану. Таким образом, клетка приобретает поверхностные рецепторы, с помощью которых она может связать антиген, и с этого момента ее называют виргильным В-лимфоцитом. Многие из виргильных В-клеток вскоре начинают вырабатывать также и поверхностные молекулы IgD, имеющие тот же антиген-связывающий участок, что и молекулы IgM.

IgM - не только первый класс антител, появляющихся на поверхности развивающихся В-клеток; это также основной класс антител,

выделяв-

232

Таблица 18-1. Свойства основных классов антител, образующихся у человека

			Класс антител
Свойства
	IgM	IgD	IgG	IgA	IgE
Типы тяжелых цепей	µ	δ	γ	α	ε
Типы легких цепей	или λ	или λ	. или λ	или λ	или λ
Число четырехцепочечных	5	1	1	1 или 2	1
единиц
Доля от общего количества Ig в	10	< 1	75	15	< 1
крови, %
Способность активировать	+ + + +	—	+ +	—	—
комплемент
Прохождение через плаценту	—	—	+	—	—
Связывание с макрофагами и	—	—	+	—	—
нейтрофилами
Связывание с тучными клетками и	—	—	—	—	+
базофилами

мых в кровь на ранних стадиях первичного иммунного ответа. В секретаруемой форме IgM состоит из пяти четырехцепочечных единиц, так что в общей сложности IgM имеет 10 антиген-связывающих участков Каждый пентамер содержит полипептидную цепь еще одного типа, называемую J- цепью (joining chain). J-цепь синтезируется клетками. выделяющими IgM, и ковалентно встраивается между двумя смежными Fc-областями, где она замыкает кольцевую структуру олигомера и препятствует дальнейшей полимеризации (рис. 18-17).

Присоединение антигена к Fab-областям секретируемой пентамерной молекулы IgM индуцирует связывание Fc-областей с первым компонентом системы комплемента и его активацию. Если при этом антиген расположен на поверхности внедряющегося микроорганизма, то в результате активации система комплемента осуществляет биохимическую

Рис. 18-17. Пентамерная молекула IgM. Пять субъединиц соединены дисульфидными связями. Единственная J-цепь (мол. масса ~ 15 000), связанная дисульфидными мостиками с двумя тяжелыми µ-цепями, замыкает кольцевую структуру и предотвращает дальнейшую полимеризацию. J-цепь гомологична одиночному домену Ig (разд. 18.3.3).

233

Рис. 18-18. Бактерия, покрытая антителами IgG, эффективно фрагоцитируется макрофагом или нейтрофилом с поверхностными рецепторами, способными связывать Fcобласть молекулы IgG. Связывание покрытой антителами бактерии с этими Fc-рецепторами активирует процесс фагоцитоза (разд. 6.5.14).

атаку, приводящую к гибели микроорганизма (разд. 18.5). Молекулы IgD в отличие от IgM редко секретируются активными В-клетками, и у них не известно никаких функций, кроме роли рецепторов для антигена.

Основной класс иммуноглобулинов, находящихся в крови, составляют IgG, производимые в больших количествах при вторичном иммунном ответе. Помимо активации системы комплемента Fc-область молекул IgG связывается со специфическими рецепторами макрофагов и нейтрофилов. В большой мере благодаря таким Fc-рецепторам эти фагоцитирующие клетки могут связывать, поглощать и разрушать внедрившиеся микроорганизмы, покрытые IgG-антителами, которые были выработаны в ответ на инфекцию (рис. 18-18). Различные типы лейкоцитов, несущие Fc-рецепторы, могут убивать также и покрытые IgG чужеродные эукариотические клетки, не фагоцитируя их. Этот процесс, называемый антителозависимой клеточной цитотоксичностъю, могут осуществлять макрофаги, нейтрофилы и эозинофилы (см. ниже), а также клеткикиллеры (К-клетки). Киллеры - это лимфоцитоподобные клетки, специализированные, по-видимому, для убивания аномальных клеток собственного организма (разд. 18.6.4).

Молекулы IgG-единственные антитела, которые могут переходить от матери к плоду через плаценту. Клетки плаценты, соприкасающиеся с материнской кровью, имеют Fc-рецепторы, связывающие молекулы IgG, что обеспечивает их переход в кровеносную систему плода. Антитела сначала поглощаются путем эндоцитоза при участии рецепторов, а затем транспортируются в пузырьках через клетку и выводятся путем экзоцитоза в кровь плода (процесс, называемый трансцитозом, см. разд. 6.5.11). Антитела других классов не связываются с этими рецепторами и поэтому не могут проходить через плаценту.

IgA-основной класс антител в секретах (молоке, слюне, слезах, секретах дыхательных путей и кишечного тракта). Он представлен главным образом четырехцепочечными мономерами (подобно IgG) или же димерами, содержащими одну J-цепь и одну цепь, называемую секреторным компонентом (рис. 18-19). В составе секретов IgA представляет собой димер. Он транспортируется из внеклеточной жидкости в секретируемую жидкость таким же способом, как молекулы IgG-из материнской крови в кровь плода, т. е. путем трансцитоза. В данном случае в транспорте участвуют Fc-рецепторы особого типа, которые имеются на базальной поверхности эпителиальных клеток, выстилающих кишечник, бронхи или протоки молочных, слюнных или слезных желез. Здесь Fc-рецепторы связывают димеры IgA из внеклеточной жидкости (рис. 18-20).

Fc-область молекул IgE связывается с Fc-рецепторами еще одного типа, обладающими необычно высоким сродством к ней (Ка ~ 1010 л/моль). Эти рецепторы имеются на поверхности тучных клеток в тка-

Рис. 18-19. Строение димерной молекулы антител IgA, содержащихся в секретах (сильно упрощенная схема). В дополнение к двум мономерам IgA, которые связаны одним дисульфидным мостиком между тяжелыми α -цепями, комплекс содержит также J-цепь и добавочную полипептидную цепь с мол. массой 70000 дальтон, называемую секреторным компонентом. Как полагают, эта цепь защищает молекулы IgA от переваривания протеолитическими ферментами секретов.

234

235

Рис. 18-20. Механизм переноса димерной молекулы IgA через эпителиальную клетку. IgA связывается на базальной поверхности эпителиальной клетки со специализированным трансмембранным белком - Fc-рецептором. Комплексы рецептор-lgA поглощаются путем эндоцитоза при участии этого рецептора, переносятся в пузырьках через цитоплазму эпителиальной клетки и секретируются в проток железы на противоположной стороне клетки путем экзоцитоза. Здесь часть Fc-рецептора, связанная с димером IgA (секреторный компонент), отщепляется от трансмембранного «хвоста», высвобождая таким образом антитело в виде комплекса в проток.

Во внеклеточную жидкость секреторных органов попадают димеры IgA из двух источников: одни вырабатываются в этих же органах плазматическими клетками, секретирующими IgA, а другие образуются в селезенке и лимфатических узлах, откуда переходят в кровяное русло и затем просачиваются из капилляров в разных тканях.

нях и базофилов в крови (разд. 17.5.1), а связанные ими молекулы IgE в свою очередь служат рецепторами для антигена. Присоединение антигена приводит к выделению клетками биологически активных аминов (в особенности гистамина, а у некоторых видов - серотонина) (рис. 18-21). Эти амины вызывают расширение кровеносных сосудов и увеличивают проницаемость их стенок; они в большой мере ответственны за клинические проявления таких аллергических реакций, как сенная лихорадка, астма и крапивница. Как полагают, при обычных обстоятельствах эти изменения кровеносных сосудов делают область воспаления более доступной для лейкоцитов, антител и компонентов комплемента. Тучные клетки секретируют также факторы, привлекающие и активирующие особый класс лейкоцитов - эозинофилы (разд. 17.5.1), которые могут убивать различного рода паразитов, особенно если те покрыты IgG-антителами.

18.2.6. Антитела могут иметь или -, или λ,-цепи, но не те и другие

В дополнение к пяти классам Н-цепей у высших позвоночных в антителах имеются два типа L-цепей - и λ, каждый из которых может сочетаться с любой Н-цепью. Отдельная молекула антитела всегда состоит из двух идентичных L-цепей и двух идентичных Н-цепей; поэтому ее два антиген-связывающих участка всегда совершенно одинаковы. Такая симметрия имеет решающее значение для сшивающей функции секретируемых антител. Поэтому молекула Ig может иметь

Рис. 18-21. Тучные клетки (и базофилы) пассивно приобретают поверхностные рецепторы, связывающие антиген. Антитела IgE, выделяемые активными В-лимфоцитами, попадают в ткани и связываются Fc-рецепторами на поверхности тучных клеток, специфически узнающими Fc-область этих антител. Поэтому отдельные тучные клетки (и базофилы) в отличие от В-клеток имеют на своей поверхности антитела с целым рядом различных антиген-связывающих участков. Когда молекула антигена присоединяется к этим мембраносвязанным антителам IgE и тем самым сшивает соседние молекулы IgE, она активирует тучную клетку и та высвобождает гистамин путем экзоцитоза.

236

L-цепи и λ, но не ту и другую одновременно. Каких-либо различий в биологической функции этих двух типов L-цепей пока не установлено.

18.2.7. Сила взаимодействия антигена с антителом зависит как от сродства, так и от числа связывающих участков

[16]

Связывание антигена с антителом, так же как и субстрата с ферментом, обратимо. Оно определяется суммой многих относительно слабых нековалентных взаимодействий, включая гидрофобные и водородные связи, вандерваальсовы силы и ионные взаимодействия. Эти слабые взаимодействия эффективны только в том случае, если молекулы антигена и антитела настолько комплементарны друг другу, что некоторые атомы антигена входят в соответствующие углубления на поверхности антитела. Комплементарные антигену области четырехцепочечной молекулы антитела - это ее два идентичных антиген-связывающих участка; соответствующая область антигена - его антигенная детерминанта (рис. 18-22). Большинство антигенных макромолекул имеют много различных детерминант; если две из них или большее число (как в некоторых полимерах) одинаковы, антиген называют мультивалентным (рис. 18-23).

Обратимую реакцию между антигеном с одной антигенной детерминантой (Аг) и одним антиген-связывающим участком (Ат) можно представить следующим образом:

Аг+Ат АгАт.

Точка равновесия зависит как от концентраций Ат и Аг, так и от силы их взаимодействия. Очевидно, что с увеличением концентрации Аг все большая доля Ат будет ассоциирована с Аг. Силу взаимодействия обычно выражают константой сродства (Ка) (см. рис. 3-7):

Ка = [АгАт]/[Аг][Ат] (выражения в квадратных скобках означают концентрацию каждого из компонентов в состоянии равновесия).

Константу сродства, которую иногда называют константой ассоциации, можно определить, измерив концентрацию свободного Аг, необходимую для заполнения половины антиген-связывающих участков антитела. Когда половина участков заполнена, [АгАт] = [Ат] и Ка = 1/[Аг]. Таким образом, константа сродства антитела к антигену равна величине,

Рис. 18-22. Сильно упрощенная схема связывания антигенной детерминанты макромолекулы с антиген-связывающими участками двух различных антител - с высоким и с низким сродством к данному антигену. Антигенная детерминанта удерживается в связывающем участке различными слабыми нековалентными взаимодействиями. Обратите внимание на то, что в образование этого участка обычно вносят вклад как легкая, так и тяжелая цепи молекулы антитела.

237

Рис. 18-23. Молекулы с множественными антигенными детерминантами. А. Глобулярный белок, имеющий ряд различных антигенных детерминант. Обратите внимание, что разные области полипептидной цепи могут в свернутой структуре сближаться друг с другом, образуя единую детерминанту на поверхности белка. Б. Полимерная структура с повторяющимися идентичными антигенными детерминантами; такую молекулу называют мультивалентным антигеном.

обратной концентрации антигена, дающей половину максимального связывания. Обычные значения варьируют в широких пределах - от 5-104 до 1011 л/моль. Константа сродства, при которой молекулу иммуноглобулина перестают рассматривать как антитело к данному антигену, несколько произвольна, однако антитело с Ка ниже 104 вряд ли будет биологически эффективным; кроме того, маловероятно, что В-клетки с рецепторами, имеющими столь слабое сродство к антигену, будут им активироваться.

Сродство антитела отражает силу взаимодействия антигенной детерминанты с отдельным антиген-связывающим участком, каким бы ни было число таких участков. В отличие от этого общая авидность антитела по отношению к мультивалентному антигену (такому, как полимер с повторяющимися субъединицами) характеризует суммарную силу взаимодействия всех связывающих участков антитела, вместе взятых. Когда мультивалентный антиген взаимодействует более чем с одним антиген-связывающим участком антитела, сила связывания резко возрастает: для того чтобы антиген и антитело могли диссоциировать, все их связи друг с другом должны быть разорваны одновременно. Поэтому типичная молекула IgG при вовлечении в реакцию обоих антиген-связывающих участков будет связываться с мультивалентным антигеном по меньшей мере в 1000 раз сильнее, чем в случае, когда вовлечен лишь один участок.

По той же причине, если сродство отдельных антиген-связывающих участков IgG и IgM одинаково, молекула IgM (имеющая 10 таких участков) проявит несравненно большую авидность к мультивалентному антигену, чем молекула IgG (имеющая 2 участка). Различие в авидности, часто 10000-кратное или больше, весьма важно, так как антитела, образующиеся на ранних стадиях иммунного ответа, обычно обладаю: значительно меньшим сродством к антигену, чем те, которые вырабатываются позже. (Повышение среднего сродства продуцируемых антител с течением времени после иммунизации называется созреванием сродства - см. разд. 18.4.4.) Благодаря своей высокой общей авидности антитела IgM (основной класс Ig, вырабатываемых в начале иммунного ответа) могут эффективно функционировать даже при низком сродстве отдельных связывающих участков.

Заключение

Молекула антитела представляет собой белок, имеющий форму буквы Y с двумя идентичными антиген-связывающими участками на концах боковых ветвей (Fab-областей) и с участками для связывания с компонентами комплемента и/или различными рецепторами клеточной поверхности на «стебельке» (на Fc-области). Антитела защищают позвоночных от инфекций, инактивируя вирусы или бактериальные токсины и мобилизуя комплемент и различные клетки, которые убивают и поглощают внедрившиеся микроорганизмы.

Каждый клон В-клеток вырабатывает молекулы антител с уникальным антиген-связывающим участком. Вначале молекулы встраиваются в плазматическую мембрану клетки, где они служат рецепторами дм антигена. Когда к таким рецепторам присоединяется антиген, В-клетки активируются (обычно с помощью Т-клеток), начинают размножаться и созревают либо в клетки памяти, либо в активные клетки, выделяющие антитела с таким же антиген-связывающим участком, как и у антител встроенных в мембрану.

Каждая молекула антитела составлена из двух идентичных тяжелых (Н) цепей и двух идентичных легких (L) цепей. Как правило, част как Н~, так и L-цепей образуют антиген-связывающие участки. Сущест-

238

вуют пять классов антител (IgA, IgD, IgE, IgG и IgM), имеющие соответственно различные Н-цепи (α, δ, ε, γ и µ). Н-цепи образуют также Fcобластъ антитела, от которой зависит, какие другие белки будут связываться с антителом, что в свою очередь определяет биологические

свойства данного класса антител. С любым классом Н-цепей могут сочетаться L-цепи любого типа (или λ). Тип L-цепи, по-видимому, не влияет на свойства антител.

18.3. Тонкая структура антител

Поскольку антитела существуют в столь огромном числе вариантов, в неиммунизированном организме любой из видов антител будет составлять менее миллионной доли всех молекул Ig, имеющихся в крови. Этот факт поставил иммунохимиков перед чрезвычайно сложной проблемой белковой химии: каким образом можно получить достаточное количество какого-либо антитела для определения его аминокислотной последовательности и трехмерной структуры?

Проблема была решена благодаря специфическому свойству опухолевых клеток, образующихся при множественной миеломе - злокачественном заболевании, при котором в костном мозге («миелогенной» ткани) развиваются множественные опухоли. Эти клетки секретируют в кровь большие количества антител одного вида. Такие антитела гомогенны, или моноклональны, поскольку рак обычно начинается с неконтролируемого роста одной-единственной клетки (см. разд. 21.1.2); в данном случае это плазматическая клетка, вырабатывающая антитела. Антитело, накапливающееся в крови, называют миеломным белком.

Еще с прошлого столетия известно, что моча больных, страдающих этим заболеванием, часто содержит необычные белки, названные белками Бенс-Джонса по имени английского врача, который их впервые описал. Однако только в 1950-х годах выяснилось, что эти белки представляют собой свободные L-цепи иммуноглобулина. Первоначально детальная структура антитела была определена путем изучения миеломных белков из мочи или крови больных или же белков от мышей, у которых были целенаправленно индуцированы аналогичные формы рака. Впоследствии появилась возможность делать В-клетки, секретирующие антитела, бессмертными путем их слияния с клетками миеломы, не секретирующими антитела. Образующиеся гибридомы стали удобным источником моноклональных антител, которые можно получить против любого желаемого антигена в неограниченном количестве (разд. 4.5.4).

18.3.1. L- и Н-цепи состоят из константной и вариабелыюй областей [11, 14]

При сравнении аминокислотных последовательностей множества миеломных белков выявилась поразительная особенность, имеющая важный и неожиданный генетический подтекст. N-концевая часть последовательности как L-, так и Н-цепей изменчива, а С-концевая-постоянна.

Например, если сравнить последовательности большого числа различных миеломных -цепей (каждая длиной около 220 аминокислот), то окажется, что С-концевые половины у них одинаковы или различаются лишь незначительно, тогда как N-концевые половины все разные. Таким образом, L-цепи содержат константную область примерно из 110 аминокислот и вариабельную область такой же длины. N-концевая вариабельная область Н-цепей тоже состоит приблизительно из 110 аминокислот, константная же, в зависимости от класса антител, - из 330 или 440 аминокислот (рис. 18-24).

Именно N-концевые части L- и Н-цепей совместно образуют антиген-

239

Рис. 18-24. Как легкие, так и тяжелые цепи молекул состоят из константной и вариабельной областей. У всех легких цепей данного типа (æ или λ) вся С-концевая половина имеет одинаковую последовательность аминокислот (иногда с небольшими различиями), тогда как N-концевые половины различны. N-концевые вариабельные области тяжелых и легких цепей сходны по длине (около 110 аминокислотных остатков), тогда как константная область у тяжелых цепей в три-четыре раза (в зависимости от класса антител) длиннее, чем у легких цепей.

связывающий участок, и изменчивость их аминокислотных последовательностей служит структурной основой разнообразия таких участков, В связи с существованием вариабельной и константной областей возникают важные вопросы относительно генетических механизмов образования антител; их мы обсудим позже. Но еще до того как стало возможным прямое изучение этих вопросов, в результате исследования миеломных белков выяснились другие важные черты структуры антител.

18.3.2. Каждая L- и Н-цепь содержит по три гипервариабельные области, которые совместно формируют антигенсвязывающий участок [17]

Только часть вариабельной области непосредственно участвует в связывании антигена. Этот вывод вначале был сделан в результате оценки максимальных размеров антиген-связывающего участка. Первые измерения, в которых «молекулярными линейками» служили олигомеры разной величины, были проведены на антителах к декстрану - полимеру D-глюкозы. Когда для того, чтобы подавить связывание декстрана с антителами к нему, использовали дисахариды, трисахариды и олигосахариды большей длины, состоящие из остатков глюкозы, то их действие возрастало по мере удлинения цепи приблизительно до шести мономеров; с олигосахаридами большей длины эффект не увеличивался, Это позволяло предполагать, что наиболее крупные антиген-связывающие участки могут контактировать самое большее с пятью или шестью сахарными остатками антигена. Поэтому казалось крайне маловероятным, что все 220 аминокислот вариабельных областей L- и Н-цепей вносят прямой вклад в построение антиген-связывающего участка.

И действительно, теперь ясно, что связывающий участок антитела формируют всего лишь около 20-30 аминокислотных остатков вариабельной области каждой из цепей. Первым свидетельством в пользу этого явились данные об аминокислотных последовательностях, показавшие, что различия между вариабельными областями как в L-, так и в Н-цепях в основном ограничены тремя небольшими

гипервариабельиыми

Рис. 18-25. На этой сильно упрощенной схеме показано, как три гипервариабельные области каждой легкой и тяжелой цепи совместно образуют антиген-связывающий участок молекулы антитела. Гипервариабельные области иногда называют областями, определяющими комплементарность.

240

областями в каждой цепи. Остальные части, известные под названием структурных областей, относительно постоянны. Эти данные позволили предсказать, что антиген-связывающий участок образуют всего лишь 5-10 аминокислот каждой гипервариабельной области (рис. 18-25), и это было впоследствии подтверждено рентгеноструктурным анализом антител (см. ниже).

18.3.3. L- и Н-цепи свернуты в ряд повторяющихся гомологичных доменов [11, 16, 18]

Когда к концу 60-х годов была впервые определена полная последовательность аминокислот в одной из Н-цепей, стала очевидной другая важная особенность структуры Ig. Оказалось, что константная область, которая в большинстве Н-цепей примерно в три раза длиннее, чем в L- цепях, состоит из трех гомологичных сегментов, причем каждый из них, длиной около ПО аминокислот, содержит по одной внутрицепочечной дисульфидной связи. Эти три сегмента гомологичны не только друг другу, но также и константной области L-цепей. Единственные вариабельные домены в L- и Н-цепях тоже сходны между собой, а в меньшей степени - и с константными доменами.

Эти данные позволили предсказать, что как L-, так и Н-цепи построены из повторяющихся сегментов, или доменов, каждый из которых сворачивается независимо, образуя компактную функциональную единицу. И действительно (рис. 18-26), L-цепь состоит из одного вариабельного домена (VL) и одного константного (CL), а большинство Н-цепей - из вариабельного домена (VH) и трех константных доменов (CN1, CN2 и CN3). (Каждая µ- и ε-цепь содержит один вариабельный и четыре константных домена.) Вариабельные домены ответственны за связывание антигена, а константные домены Н-цепей (за исключением CN1) образуют Fc-область, определяющую другие биологические свойства антител.

Гомология между доменами позволяет предположить, что цепи Ig возникли в ходе эволюции в результате ряда последовательных дупликаций одного исходного гена, который кодировал один-единственный домен с неизвестной функцией, состоявший из 110 аминокислот (разд. 18.6.20). Эту гипотезу подкрепляют данные о том, что каждый домен константной области Н-цепи кодируется отдельной последовательностью ДНК (экзоном) (рис. 18-27).

Рис. 18-26. Каждая из легких и тяжелых цепей в молекуле Ig свернута в повторяющиеся домены, сходные друг с другом. Вариабельные домены тех

идругих цепей (VL и VH) образуют антиген-связывающие участки (см. рис. 18-25), тогда как константные домены тяжелых цепей (главным образом СН2 и СН3) определяют другие биологические свойства молекулы. Тяжелые цепи антител IgM и IgE имеют дополнительный константный домен

СН4.