- •Учебное пособие
- •Раздел 1. Структура и свойства ферментов
- •Инженерная энзимология. Иммобилизованные ферменты. Новые пути практического использования ферментов. Применение ферментов в промышленности, сельском хозяйстве, медицине
- •Принцип классификации ферментов. Классы ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Основные положения систематической и тривиальной номенклатуры ферментов
- •Способы количественного выражения активности ферментов. Единицы активности. Удельная и молекулярная активность
- •Методы определения активности ферментов: колориметрический, спектрофотометрический, флуориметрический, манометрический, биолюминесцентный и др.
- •Прямой и непрямой оптический тест Варбурга. Расчет ферментативной активности при определении по конечной точке и при кинетическом определении
- •Лекция 1.2 выделение и очистка ферментов
- •Разрушение клеток и экстракция белков
- •Тепловая денатурация
- •Осаждение белков
- •Гель-фильтрация
- •Разделение белков путем адсорбции
- •Выбор ионообменника
- •Элюция адсорбированного белка
- •Аффинная хроматография
- •Гидрофобная хроматография
- •Металлохелатная аффинная хроматография
- •Высокоэффективная жидкостная хроматография
- •Электрофорез
- •Изоэлектрическое фокусирование
- •Капиллярный электрофорез
- •Двумерные системы электрофореза
- •Кристаллизация белков
- •Лекция 1.3 уровни структурной организации ферментов
- •Многостадийный процесс образования пространственной структуры белка
- •Механизмы регуляции процесса сворачивания полипептидной цепи внутри клетки
- •Ферменты, участвующие в фолдинге белка
- •Специальные белки, увеличивающие эффективность сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию
- •Посттрансляционная модификация белка
- •Роль доменов в пространственной организации молекул ферментов
- •Увеличение числа доменов в ферменте и усложнение взаимодействий между ними
- •Роль доменов в формирование активного центра фермента
- •Роль доменов в регуляции ферментативной активности
- •Роль доменов в связывание ферментов с мембранами
- •Полифункциональные ферменты
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие реакции одного метаболического пути
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие противоположно направленные реакции
- •Лекция 1.4 Кофакторы ферментов и их роль в катализе Коферменты, простетические группы, ионы металлов
- •Классификация кофакторов
- •Функции кофакторов
- •Кофакторы окислительно-восстановительных процессов Никотинамидные кофакторы
- •Кофакторы переноса групп Коферменты – производные пиридоксина
- •Кофакторы процессов синтеза, изомеризации и расщепления с-с связей Биотин
- •Роль металлов в функционировании ферментов
- •Лекция 1.5. Топография активных центров простых и сложных ферментов
- •Методы изучения активных центров ферментов
- •Раздел 2. Кинетика и термодинамика
- •Ферментативных реакций
- •Лекция 2.1.
- •Кинетика химических реакций
- •Скорость химической реакции
- •Основной постулат химической кинетики ‒ закон действия масс
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Реакции третьего порядка
- •Уравнения односторонних реакций 0-го, 1-го и 2-ого порядка
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Молекулярность элементарных реакций
- •Методы определения порядка реакции
- •Зависимость скорости реакции от температуры. Уравнения Вант-Гоффа и Аррениуса.
- •Катализ
- •Лекция 2.2. Стационарная кинетика ферментативный реакций
- •Уравнение Михаэлиса-Ментен
- •Характеристика кинетических констант
- •Методы определения Км и Vmax
- •Лекция 2.3. Ингибиторы ферментов.
- •Конкурентное ингибирование
- •Неконкурентное ингибирование
- •Бесконкурентное ингибирование
- •Смешанный тип ингибирования
- •Субстратное ингибирование
- •Методы определения константы ингибирования. Метод Диксона
- •Лекция 2.4 Ферменты, не подчиняющиеся кинетике Михаэлиса-Ментен
- •Методы определения коэффициента Хилла
- •Раздел 3.Механизмы ферментативного катализа
- •Сущность явления катализа
- •Стадии образования фермент-субстратного комплекса
- •Природа сил, стабилизирующих различные конформационные состояния ферментсубстратного комплекса
- •Электростатические взаимодействия
- •Водородные связи
- •Вандерваальсовы взаимодействия
- •Гидрофобные взаимодействия
- •Факторы, определяющие эффективность и специфичность ферментативного катализа
- •Физико-химические механизмы ферментативного катализа
- •Лекция 3.2
- •Механизм действия гидролаз на примере карбоксипептидазы а
- •Связывание субстрата карбоксипептидазой а
- •Работы Липскомба с сотрудниками по установлению молекулярного механизма действия кпа
- •Методы для изучения механизма действия ферментов
- •Лекция 3.3 Специфичность – уникальное свойство ферментов
- •Относительная или групповая специфичность действия
- •Абсолютная специфичность действия
- •Стереоспецифичность ферментов
- •Концепция стерического соответствия «ключ-замок»
- •Концепция индуцированного соответствия
- •Раздел 4. Контроль активности ферментов лекция 4.1. Ферменты в клетке и организованных системах
- •Распределение ферментов в клетке
- •Ферменты, присутствующие в ядре
- •Ферменты митохондрий
- •Лизосомальные ферменты
- •Ферменты эндоплазматического ретикулума
- •Ферменты, локализованные в цитозоле
- •Мембранные ферменты
- •Уровни структурной организации ферментов в клетке
- •Мультиферментные комплексы
- •Пируватдегидрогеназный комплекс
- •Мультиферментные конъюгаты
- •Метаболоны
- •Лекция 4.2 Изостерические и аллостерические механизмы регуляции активности ферментов
- •Изостерическая регуляция
- •Vmax·[s]
- •Изоферменты
- •Лекция 4.3 ковалентная модификация ферментов и ее типы
- •Лекция 4.4
- •Регуляция количества ферментов в клетке
- •Контроль количества ферментов в клетке – процесс, зависящий от соотношения скоростей их биосинтеза и деградации.
- •Время полужизни различных ферментов
- •Фермент
- •Аминокислоты
- •Биосинтез ферментов и его регуляция на генетическом уровне. Конститутивные и индуцибельные (адаптивные) ферменты. Репрессия и индукция биосинтеза ферментов
- •Убиквитин-протеосомный путь деградации белков у эукариот. Убиквитин – белок, маркирующий белки для деградации. Строение 26s протеосомы
- •Раздел 5. Прикладное значение ферментов лекция 5.1. Генетическая инженерия ферментов
- •Использование рекомбинантных ферментов
- •Лекция 5.2 Ферменты в медицине (часть I)
- •Энзимодиагностика Органная специфичность в распределении ферментов
- •Ферменты сыворотки крови
- •Факторы, влияющие на уровень ферментов во внеклеточной жидкости
- •Диагностическое значение снижения ферментативной активности
- •Неспецифическое повышение ферментативной активности
- •Применение ферментов в качестве аналитических реагентов
- •Лактатдегидрогеназа
- •Лекция 5.3 Ферменты в медицине (часть II) Энзимопатии
- •Врождённые (наследственные) энзимопатии
- •Механизм возникновения наследственных энзимопатий
- •Блок обмена веществ
- •Примеры наследственных энзимопатий
- •Приобретённые энзимопатии
- •Энзимотерапия Использование ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Библиографический список
Кофакторы переноса групп Коферменты – производные пиридоксина
Ряд различных реакций катализируется ферментами, коферментами которых являются производные пиридоксина (витамина В6).
Пиридоксин имеет следующее строение:
Рис. 1.4.16. Структура пиридоксина
Витамин В6 может давать различные производные, и они, а не сам витамин В6, входят в состав различных ферментов. Производными пиридоксина, играющими роль коферментов, являются пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат, строение которых представлено ниже:
Рис. 1.4.17. Структура пиридоксальфосфата и пиридоксаминфосфата
Большинство ферментативных реакций, коферментами которых являются пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат, связано с различными превращениями аминокислот. Однако было показано, что пиридоксальфосфат входит в состав фермента, который никакого отношения к превращениям аминокислот не имеет, а именно α-глюканфосфорилазы. Этот фермент катализирует перенос глюкозильных групп между различными полиглюкозидами (например, крахмалом или гликогеном) или неорганическим фосфатом. Роль пиридоксальфосфата в молекуле фосфорилазы заключается не в том, что он является ее коферментом, а в том, что альдегидная группа пиридоксальфосфата, связываясь с аминогруппами фермента, поддерживает третичную структуру молекулы фосфорилазы.
Одной из важных групп ферментов, у которых в качестве коферментов выступают пиридоксаль и его производные, являются аминотрансферазы, то есть ферменты, которые переносят аминогруппы от одного соединения на другое.
Реакция ферментативного переаминирования была открыта А. Е. Браунштейном с сотрудниками. Реакции переаминирования играют важную роль в обмене веществ. Наиболее важными реакциями переаминирования являются следующие три. Перваяиз них такова:
глютаминовая кислота |
|
щавелевоуксусная кислота |
|
α-кето- глутарат |
|
аспарагиновая кислота |
CООH CH2 CH2 СН─ NН2 СОOН
|
+
|
CООH СН2 С═ O СООН |
|
CООH CH2 CH2 С═ O СОOН
|
+ |
CООH CH2 СН─ NН2 СООН |
Вторая важная реакция переаминирования, катализируемая аминотрансферазой, это взаимодействие между глютаминовой и пировиноградной кислотами:
глютаминовая кислота |
|
пировиноградная кислота |
|
α-кето- глутарат |
|
α-аланин
|
CООH CH2 CH2 СН─ NН2 СОOН |
+
|
СН3 С═ O СООН |
|
CООH CH2 CH2 С═ O СОOН |
+ |
CH3 СН─ NН2 СООН |
В результате этой реакции из глютаминовой кислоты образуется α-кетоглютаровая кислота, а из пировиноградной кислоты α-аланин.
И наконец, третья реакция ферментативного переаминирования – это реакция между аспарагиновой кислотой и пировиноградной кислотой. В результате этой реакции образуется из аспарагиновой кислоты соответствующая ей кетокислота – щавелевоуксусная, а из пировиноградной кислоты – соответствующая ей аминокислота – α-аланин.
аспарагиновая кислота |
|
пировиноградная кислота |
|
щавелевоуксусная кислота |
|
α-аланин
|
CООH CH2 СН─ NН2 СОOН |
+
|
СН3 С═ O СООН |
|
CООH СН2 С═ O СООН |
+ |
CH3 СН─ NН2 СООН |
В последние годы, благодаря применению более чувствительных методов определения различных соединений, например метода хроматографии, удалось показать, что в живой клетке кроме трех указанных выше реакций протекают самые разнообразные реакции ферментативного переаминирования. Например, показано, что важную роль в обмене играют фосфопиридоксалевые ферменты, которые названы декарбоксилазами аминокислот. Эти ферменты катализируют отщепление от аминокислот углекислоты. Типичным представителем декарбоксилаз аминокислот является глютаматдекарбоксилаза, которая катализирует расщепление глютаминовой кислоты на СО2 и γ-аминомасляную кислоту. К числу декарбоксилаз аминокислот принадлежат также декарбоксилазы аспарагиновой кислоты или аспартатдекарбоксилазы. Под действием этих ферментов может происходить образование либо α-аланина, либо β-аланина, в зависимости от того, из какой карбоксильной группы аспарагиновой кислоты выделяется СО2.