- •Учебное пособие
- •Раздел 1. Структура и свойства ферментов
- •Инженерная энзимология. Иммобилизованные ферменты. Новые пути практического использования ферментов. Применение ферментов в промышленности, сельском хозяйстве, медицине
- •Принцип классификации ферментов. Классы ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Основные положения систематической и тривиальной номенклатуры ферментов
- •Способы количественного выражения активности ферментов. Единицы активности. Удельная и молекулярная активность
- •Методы определения активности ферментов: колориметрический, спектрофотометрический, флуориметрический, манометрический, биолюминесцентный и др.
- •Прямой и непрямой оптический тест Варбурга. Расчет ферментативной активности при определении по конечной точке и при кинетическом определении
- •Лекция 1.2 выделение и очистка ферментов
- •Разрушение клеток и экстракция белков
- •Тепловая денатурация
- •Осаждение белков
- •Гель-фильтрация
- •Разделение белков путем адсорбции
- •Выбор ионообменника
- •Элюция адсорбированного белка
- •Аффинная хроматография
- •Гидрофобная хроматография
- •Металлохелатная аффинная хроматография
- •Высокоэффективная жидкостная хроматография
- •Электрофорез
- •Изоэлектрическое фокусирование
- •Капиллярный электрофорез
- •Двумерные системы электрофореза
- •Кристаллизация белков
- •Лекция 1.3 уровни структурной организации ферментов
- •Многостадийный процесс образования пространственной структуры белка
- •Механизмы регуляции процесса сворачивания полипептидной цепи внутри клетки
- •Ферменты, участвующие в фолдинге белка
- •Специальные белки, увеличивающие эффективность сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию
- •Посттрансляционная модификация белка
- •Роль доменов в пространственной организации молекул ферментов
- •Увеличение числа доменов в ферменте и усложнение взаимодействий между ними
- •Роль доменов в формирование активного центра фермента
- •Роль доменов в регуляции ферментативной активности
- •Роль доменов в связывание ферментов с мембранами
- •Полифункциональные ферменты
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие реакции одного метаболического пути
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие противоположно направленные реакции
- •Лекция 1.4 Кофакторы ферментов и их роль в катализе Коферменты, простетические группы, ионы металлов
- •Классификация кофакторов
- •Функции кофакторов
- •Кофакторы окислительно-восстановительных процессов Никотинамидные кофакторы
- •Кофакторы переноса групп Коферменты – производные пиридоксина
- •Кофакторы процессов синтеза, изомеризации и расщепления с-с связей Биотин
- •Роль металлов в функционировании ферментов
- •Лекция 1.5. Топография активных центров простых и сложных ферментов
- •Методы изучения активных центров ферментов
- •Раздел 2. Кинетика и термодинамика
- •Ферментативных реакций
- •Лекция 2.1.
- •Кинетика химических реакций
- •Скорость химической реакции
- •Основной постулат химической кинетики ‒ закон действия масс
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Реакции третьего порядка
- •Уравнения односторонних реакций 0-го, 1-го и 2-ого порядка
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Молекулярность элементарных реакций
- •Методы определения порядка реакции
- •Зависимость скорости реакции от температуры. Уравнения Вант-Гоффа и Аррениуса.
- •Катализ
- •Лекция 2.2. Стационарная кинетика ферментативный реакций
- •Уравнение Михаэлиса-Ментен
- •Характеристика кинетических констант
- •Методы определения Км и Vmax
- •Лекция 2.3. Ингибиторы ферментов.
- •Конкурентное ингибирование
- •Неконкурентное ингибирование
- •Бесконкурентное ингибирование
- •Смешанный тип ингибирования
- •Субстратное ингибирование
- •Методы определения константы ингибирования. Метод Диксона
- •Лекция 2.4 Ферменты, не подчиняющиеся кинетике Михаэлиса-Ментен
- •Методы определения коэффициента Хилла
- •Раздел 3.Механизмы ферментативного катализа
- •Сущность явления катализа
- •Стадии образования фермент-субстратного комплекса
- •Природа сил, стабилизирующих различные конформационные состояния ферментсубстратного комплекса
- •Электростатические взаимодействия
- •Водородные связи
- •Вандерваальсовы взаимодействия
- •Гидрофобные взаимодействия
- •Факторы, определяющие эффективность и специфичность ферментативного катализа
- •Физико-химические механизмы ферментативного катализа
- •Лекция 3.2
- •Механизм действия гидролаз на примере карбоксипептидазы а
- •Связывание субстрата карбоксипептидазой а
- •Работы Липскомба с сотрудниками по установлению молекулярного механизма действия кпа
- •Методы для изучения механизма действия ферментов
- •Лекция 3.3 Специфичность – уникальное свойство ферментов
- •Относительная или групповая специфичность действия
- •Абсолютная специфичность действия
- •Стереоспецифичность ферментов
- •Концепция стерического соответствия «ключ-замок»
- •Концепция индуцированного соответствия
- •Раздел 4. Контроль активности ферментов лекция 4.1. Ферменты в клетке и организованных системах
- •Распределение ферментов в клетке
- •Ферменты, присутствующие в ядре
- •Ферменты митохондрий
- •Лизосомальные ферменты
- •Ферменты эндоплазматического ретикулума
- •Ферменты, локализованные в цитозоле
- •Мембранные ферменты
- •Уровни структурной организации ферментов в клетке
- •Мультиферментные комплексы
- •Пируватдегидрогеназный комплекс
- •Мультиферментные конъюгаты
- •Метаболоны
- •Лекция 4.2 Изостерические и аллостерические механизмы регуляции активности ферментов
- •Изостерическая регуляция
- •Vmax·[s]
- •Изоферменты
- •Лекция 4.3 ковалентная модификация ферментов и ее типы
- •Лекция 4.4
- •Регуляция количества ферментов в клетке
- •Контроль количества ферментов в клетке – процесс, зависящий от соотношения скоростей их биосинтеза и деградации.
- •Время полужизни различных ферментов
- •Фермент
- •Аминокислоты
- •Биосинтез ферментов и его регуляция на генетическом уровне. Конститутивные и индуцибельные (адаптивные) ферменты. Репрессия и индукция биосинтеза ферментов
- •Убиквитин-протеосомный путь деградации белков у эукариот. Убиквитин – белок, маркирующий белки для деградации. Строение 26s протеосомы
- •Раздел 5. Прикладное значение ферментов лекция 5.1. Генетическая инженерия ферментов
- •Использование рекомбинантных ферментов
- •Лекция 5.2 Ферменты в медицине (часть I)
- •Энзимодиагностика Органная специфичность в распределении ферментов
- •Ферменты сыворотки крови
- •Факторы, влияющие на уровень ферментов во внеклеточной жидкости
- •Диагностическое значение снижения ферментативной активности
- •Неспецифическое повышение ферментативной активности
- •Применение ферментов в качестве аналитических реагентов
- •Лактатдегидрогеназа
- •Лекция 5.3 Ферменты в медицине (часть II) Энзимопатии
- •Врождённые (наследственные) энзимопатии
- •Механизм возникновения наследственных энзимопатий
- •Блок обмена веществ
- •Примеры наследственных энзимопатий
- •Приобретённые энзимопатии
- •Энзимотерапия Использование ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Библиографический список
Метаболоны
Одним из элементов пространственной организации ферментов является метаболон – надмолекулярный комплекс, объединяющий ферменты определенного метаболического пути. Предположение о существовании такого комплекса – гликолитического метаболона было высказано еще в 1956 г. Грином с соавт., изучавшими активность гликолитических ферментов мембранных фракций эритроцитов быка.
Метаболоны формируются на подложках, в роли которых могут выступать биологические мембраны, структурные белки мышц и некоторые клеточные структуры. Подложка содержит белок, который выполняет якорные функции.
Фиксация на подложке обеспечивает однозначность сборки комплекса, а также создает центр управления, чувствительный к новым регуляторным факторам, в первую очередь к вторичным мессенджерам.
Рассмотрим образование комплекса гликолитических ферментов в эритроцитах. По мнению Б.И. Курганова с соав. роль якорной площадки, обеспечивающей фиксацию метаболона на мембране эритроцитов, играет белок полосы 3 – интегральный мембраносвязанный гликопротеин с молекулярной массой 93 кДа, основной функцией которого является транспорт анионов через мембрану эритроцитов. Существует в димерной форме, но при образовании метаболона образует замкнутую структуру, а именно тримера димеров, т.е. гексамер (рис. 4.1.6).
Рис. 4.1.6. Гликолитический метаболон (комплекс ферментов гликолиза в эритроцитах)
В сборке метаболона на белке полосы 3 ключевую роль играет фермент фосфофруктокиназа (ФФК), самого большого по размерам гликолитического фермента. Стехиометрия связывания фермента такова: одна тетрамерная молекула ФФК связывается димером БП3. Таким образом, гексамер БП3 должен связывать 3 молекулы ФФК. Далее к ФФК присоединяется альдодаза и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (Г3ФД). Молекула эритроцитарной ФФК является тетрамером, но в отличие от мышечного фермента, построенного из идентичных субъединиц с молекулярной массой 85 кДа, фермент из эритроцитов содержит одну субъединицу мышечного типа (М) и три субъединицы (Е) с молекулярной массой 80 кДа и с аминокислотным составом, отличающимся от такового для субъединицы мышечного типа (тетрамер МЕ3). Принцип построения метаболона таков: ферменты, связанные общими метаболитами или коферментами, находятся в метаболоне рядом друг с другом. Такое расположение ферментов метаболического пути, во-первых, может обеспечить эффективное продвижение метаболических интермедиатов по конвейеру активных центров в микрокомпартменте, образующемся при сборке метаболона. Во-вторых, благодаря сближению дегидрогеназ, NADH, образующийся в ходе реакции, катализируемой Г3ФД, может прямо реокисляться до NAD+ с участием глицерол-3-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) без выхода кофермента из компартмента. Аналогично, благодаря сближению фосфотрансфераз, часть АТР, продуцируемого фосфоглицераткиназой и пируваткиназой, может использоваться ФФК.
Принцип построения метаболона таков: ферменты, связанные общими метаболитами или коферментами, находятся в метаболоне рядом друг с другом. Такое расположение ферментов метаболического пути, во-первых, может обеспечить эффективное продвижение метаболических интермедиатов по конвейеру активных центров в микрокомпартменте, образующемся при сборке метаболона. Во-вторых, благодаря сближению дегидрогеназ, NADH, образующийся в ходе реакции, катализируемой Г3ФД, может прямо реокисляться до NAD+ с участием глицерол-3-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) без выхода кофермента из компартмента. Аналогично, благодаря сближению фосфотрансфераз, часть АТР, продуцируемого фосфоглицераткиназой и пируваткиназой, может использоваться ФФК.
Гликолитический метаболон содержит тройной набор ферментов. Молекулярная масса его составляет 4х106 Да. В метаболон, изображенный на рис.4.1.6. не включен фермент гексокиназа, но она контактирует с метаболической системой. Это физиологически выгодно, поскольку в этом случае возможно прямое использование АТР, продуцируемое гликолитическим комплексом.
Сборка комплекса гликолитических ферментов приводит к образованию микрокомпартмента, в котором гликолитический процесс может протекать без выхода гликолитических интермедиатов в объем. Микрокомпартмент состоит из трех отсеков, каждый из которых содержит активные центры всех гликолитических ферментов и обеспечивает, таким образом, полную химическую трансформацию поступающего в компармент глюкозо-6-фосфата.
Метаболон – это мобильная структура, он находится в равновесии со свободными ферментами. Согласно данным Дженкинса с соавт. в интактных эритроцитах человека около 50% ФФК и 40% альдолазы связаны с мембраной. Количество полноценных комплексов, формирование которых начинается с посадки ФФК на якорную площадку мембраны эритроцитов, зависит прежде всего от соотношения между концентрацией ФФК и других белков, способных конкурировать с ФФК за связывание на белке полосы 3. К числу таких белков относится не только альдолаза и Г3ФД, но и гемоглобин. Дезоксиформа гемоглобина обладает более высоким сродством к БП3, чем оксигемоглобин, и поэтому можно ожидать, что при снижении количества кислорода в эритроцитах количество адсорбированных гликолитических ферментов будет уменьшаться.