- •Учебное пособие
- •Раздел 1. Структура и свойства ферментов
- •Инженерная энзимология. Иммобилизованные ферменты. Новые пути практического использования ферментов. Применение ферментов в промышленности, сельском хозяйстве, медицине
- •Принцип классификации ферментов. Классы ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Основные положения систематической и тривиальной номенклатуры ферментов
- •Способы количественного выражения активности ферментов. Единицы активности. Удельная и молекулярная активность
- •Методы определения активности ферментов: колориметрический, спектрофотометрический, флуориметрический, манометрический, биолюминесцентный и др.
- •Прямой и непрямой оптический тест Варбурга. Расчет ферментативной активности при определении по конечной точке и при кинетическом определении
- •Лекция 1.2 выделение и очистка ферментов
- •Разрушение клеток и экстракция белков
- •Тепловая денатурация
- •Осаждение белков
- •Гель-фильтрация
- •Разделение белков путем адсорбции
- •Выбор ионообменника
- •Элюция адсорбированного белка
- •Аффинная хроматография
- •Гидрофобная хроматография
- •Металлохелатная аффинная хроматография
- •Высокоэффективная жидкостная хроматография
- •Электрофорез
- •Изоэлектрическое фокусирование
- •Капиллярный электрофорез
- •Двумерные системы электрофореза
- •Кристаллизация белков
- •Лекция 1.3 уровни структурной организации ферментов
- •Многостадийный процесс образования пространственной структуры белка
- •Механизмы регуляции процесса сворачивания полипептидной цепи внутри клетки
- •Ферменты, участвующие в фолдинге белка
- •Специальные белки, увеличивающие эффективность сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию
- •Посттрансляционная модификация белка
- •Роль доменов в пространственной организации молекул ферментов
- •Увеличение числа доменов в ферменте и усложнение взаимодействий между ними
- •Роль доменов в формирование активного центра фермента
- •Роль доменов в регуляции ферментативной активности
- •Роль доменов в связывание ферментов с мембранами
- •Полифункциональные ферменты
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие реакции одного метаболического пути
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие противоположно направленные реакции
- •Лекция 1.4 Кофакторы ферментов и их роль в катализе Коферменты, простетические группы, ионы металлов
- •Классификация кофакторов
- •Функции кофакторов
- •Кофакторы окислительно-восстановительных процессов Никотинамидные кофакторы
- •Кофакторы переноса групп Коферменты – производные пиридоксина
- •Кофакторы процессов синтеза, изомеризации и расщепления с-с связей Биотин
- •Роль металлов в функционировании ферментов
- •Лекция 1.5. Топография активных центров простых и сложных ферментов
- •Методы изучения активных центров ферментов
- •Раздел 2. Кинетика и термодинамика
- •Ферментативных реакций
- •Лекция 2.1.
- •Кинетика химических реакций
- •Скорость химической реакции
- •Основной постулат химической кинетики ‒ закон действия масс
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Реакции третьего порядка
- •Уравнения односторонних реакций 0-го, 1-го и 2-ого порядка
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Молекулярность элементарных реакций
- •Методы определения порядка реакции
- •Зависимость скорости реакции от температуры. Уравнения Вант-Гоффа и Аррениуса.
- •Катализ
- •Лекция 2.2. Стационарная кинетика ферментативный реакций
- •Уравнение Михаэлиса-Ментен
- •Характеристика кинетических констант
- •Методы определения Км и Vmax
- •Лекция 2.3. Ингибиторы ферментов.
- •Конкурентное ингибирование
- •Неконкурентное ингибирование
- •Бесконкурентное ингибирование
- •Смешанный тип ингибирования
- •Субстратное ингибирование
- •Методы определения константы ингибирования. Метод Диксона
- •Лекция 2.4 Ферменты, не подчиняющиеся кинетике Михаэлиса-Ментен
- •Методы определения коэффициента Хилла
- •Раздел 3.Механизмы ферментативного катализа
- •Сущность явления катализа
- •Стадии образования фермент-субстратного комплекса
- •Природа сил, стабилизирующих различные конформационные состояния ферментсубстратного комплекса
- •Электростатические взаимодействия
- •Водородные связи
- •Вандерваальсовы взаимодействия
- •Гидрофобные взаимодействия
- •Факторы, определяющие эффективность и специфичность ферментативного катализа
- •Физико-химические механизмы ферментативного катализа
- •Лекция 3.2
- •Механизм действия гидролаз на примере карбоксипептидазы а
- •Связывание субстрата карбоксипептидазой а
- •Работы Липскомба с сотрудниками по установлению молекулярного механизма действия кпа
- •Методы для изучения механизма действия ферментов
- •Лекция 3.3 Специфичность – уникальное свойство ферментов
- •Относительная или групповая специфичность действия
- •Абсолютная специфичность действия
- •Стереоспецифичность ферментов
- •Концепция стерического соответствия «ключ-замок»
- •Концепция индуцированного соответствия
- •Раздел 4. Контроль активности ферментов лекция 4.1. Ферменты в клетке и организованных системах
- •Распределение ферментов в клетке
- •Ферменты, присутствующие в ядре
- •Ферменты митохондрий
- •Лизосомальные ферменты
- •Ферменты эндоплазматического ретикулума
- •Ферменты, локализованные в цитозоле
- •Мембранные ферменты
- •Уровни структурной организации ферментов в клетке
- •Мультиферментные комплексы
- •Пируватдегидрогеназный комплекс
- •Мультиферментные конъюгаты
- •Метаболоны
- •Лекция 4.2 Изостерические и аллостерические механизмы регуляции активности ферментов
- •Изостерическая регуляция
- •Vmax·[s]
- •Изоферменты
- •Лекция 4.3 ковалентная модификация ферментов и ее типы
- •Лекция 4.4
- •Регуляция количества ферментов в клетке
- •Контроль количества ферментов в клетке – процесс, зависящий от соотношения скоростей их биосинтеза и деградации.
- •Время полужизни различных ферментов
- •Фермент
- •Аминокислоты
- •Биосинтез ферментов и его регуляция на генетическом уровне. Конститутивные и индуцибельные (адаптивные) ферменты. Репрессия и индукция биосинтеза ферментов
- •Убиквитин-протеосомный путь деградации белков у эукариот. Убиквитин – белок, маркирующий белки для деградации. Строение 26s протеосомы
- •Раздел 5. Прикладное значение ферментов лекция 5.1. Генетическая инженерия ферментов
- •Использование рекомбинантных ферментов
- •Лекция 5.2 Ферменты в медицине (часть I)
- •Энзимодиагностика Органная специфичность в распределении ферментов
- •Ферменты сыворотки крови
- •Факторы, влияющие на уровень ферментов во внеклеточной жидкости
- •Диагностическое значение снижения ферментативной активности
- •Неспецифическое повышение ферментативной активности
- •Применение ферментов в качестве аналитических реагентов
- •Лактатдегидрогеназа
- •Лекция 5.3 Ферменты в медицине (часть II) Энзимопатии
- •Врождённые (наследственные) энзимопатии
- •Механизм возникновения наследственных энзимопатий
- •Блок обмена веществ
- •Примеры наследственных энзимопатий
- •Приобретённые энзимопатии
- •Энзимотерапия Использование ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Библиографический список
Механизм действия гидролаз на примере карбоксипептидазы а
Рассмотрим механизм действия гидролаз на примере такой гидролазы, как карбоксипептидаза А.
Карбоксипептидаза А (КПА) – пищеварительный фермент, вырабатывается в поджелудочной железе в виде неактивного предшественника – прокарбоксипептидазы А, которая превращается в активный фермент под действием трипсина. Фермент действует как на низкомолекулярные субстраты, так и на белки. Типичные низкомолекулярные субстраты – карбобензоксиглицил-L-фенилаланин и карбобензоксиглицил-L-триптофан. В полипептидах карбоксипептидаза А гидролизует С-концевую пептидную связь. Особенно легко гидролизуются пептиды, в которых С-концевой остаток имеет ароматическую или большую алифатическую боковую цепь (рис. 3.2.1). Фермент не действует на концевые аминокислотные остатки, если они представлены основными аминокислотами или пролином.
Рис. 3.2.1. Реакция, катализируемая карбоксипептидазой А
Этот фермент интересен в том отношении, что по механизму катализа он принципиально отличается от лизоцима. Прежде чем перейти к подробному обсуждению механизма действия карбоксипептидазы А, отметим два основных аспекта.
1. Индуцированное соответствие. Связывание субстрата сопровождается значительными изменениями структуры фермента.
2. Смещение электронов. В активном центре фермента содержатся атом цинка и другие группы, которые индуцируют перераспределение электронов в субстрате, облегчая тем самым процесс гидролиза.
Трехмерную структуру карбоксипептидазы А (рис. 3.2.2) при разрешении в 0,2 нм получил в 1967 г. Уилльям Липском (W. Lipscomb).
Рис3.2.2 Трехмерная структура карбоксипептидазы А. Показаны только α-углеродные атомы и ион цинка (заштрихованный кружок в центре)
Фермент содержит одну полипептидную цепь из 307 аминокислот, имеет компактную форму, которую можно приближенно описать как эллипсоидную с размерами 5х4,2х3,8 нм. В ферменте имеются области α-спиралей (38%) и β-складчатых слоев (17%). С белком прочно связан ион цинка, наличие которого необходимо для проявления ферментативной активности. Ион цинка расположен в углублении близко к поверхности молекулы, причем он образует координационные связи (в виде тетраэдра) с боковыми цепями двух гистидинов, боковой цепью глутамата и молекулой воды (рис. 3.2.3).
Рис. 3.2.3. Ион цинка, расположенный в активном центре карбоксипептидазы А, образует координационные связи с боковыми цепями двух гистидинов и глутамата. Занимающая 4-ю координационную связь молекула воды здесь не показана
Рядом с ионом цинка на ферменте имеется большого размера «карман», в который попадает боковая цепь концевого остатка пептидного субстрата.
Связывание субстрата карбоксипептидазой а
Связывание субстрата индуцирует большие структурные изменения активного центра карбоксипептидазы А. Представление о характере связывания субстратов с карбоксипептидазой А возникло на основе данных, полученных при изучении структуры комплекса этого фермента с глицилтирозином. Глицилтирозин – медленно гидролизуемый субстрат. Процесс его связывания (рис. 3.2.4 и 3.2.5) можно представить в виде пяти последовательных этапов.
1. Отрицательно заряженная концевая карбоксильная группа глицилтирозина вступает в электростатическое взаимодействие с положительно заряженной боковой цепью аргинина-145.
2. Субстрат через боковую цепь своего тирозина связывается в неполярном кармане фермента.
3. Водород NН-группы той пептидной связи, которая должна гидролизоваться, соединяется водородной связью с ОН-группой ароматической боковой цепи тирозина-248.
4. Карбонильный кислород той же пептидной связи вступает в координационную связь с ионом цинка.
5. Концевая аминогруппа субстрата образует водородную связь через вклинивающуюся молекулу воды с боковой цепью глутамата-270. Это взаимодействие, вероятно, не имеет места в случае реакционноспособного ЕS-комплекса, и именно оно, возможно, является причиной крайне медленного гидролиза глицилтирозина.
Рис. 3.2.4. Схематическое изображение связывания глицилтирозина в активном центре карбоксипептидазы А. Показан постулированный каталитически активный комплекс.
Рис. 3.2.5. Пространственное расположение глицилтирозина в активном центре карбоксипептидазы А. Глицилилтирозин (субстрат) изображен красным
Связывание глицилтирозина сопровождается структурной перестройкой активного центра (рис. 3.2.6). В сущности, только присоединив субстрат каталитические группы фермента принимают правильную ориентацию – положение, впервые постулированное Кошландом (Koshland) в его модели индуцированного соответствия. Гуанидиниевая группа аргинина-145, а также карбоксильная группа глутамата-270 перемещаются на 0,2 нм. Связывание карбонильной группы субстрата с ионом цинка вытесняет из связи с цинком молекулу воды. По крайней мере ещё четыре молекулы воды вытесняются из неполярного кармана на ферменте при связывании с ними тирозиновой боковой цепи в молекуле субстрата. Самое большое изменение конформации – это перемещение фенольного гидроксила тирозина-248 на 1,2 нм, то есть на расстояние, составляющее около 1/4 диаметра молекулы. Такое перемещение осуществляется в первую очередь, путем свободного вращения относительно одинарной связи -С-С- и состоит, что гидроксильная группа тирозина-248, бывшая на поверхности молекулы, перемещается, оказываясь вблизи пептидной связи субстрата. В результате закрывается полость активного центра и тем самым завершается превращение ее из области, заполненной водой, в гидрофобную. Все эти структурные изменения инициируются, по-видимому, связыванием аргинина-145 с концевой карбоксильной группой субстрата.
Рис. 3.2.6. Изменение структуры карбоксипептидазы А при связывании с субстратом
На рис. 3.2.12 буквой А обозначен фермент без субстрата (Arg 145 показан желтым, Glu 270 – зеленым, Tyr 248-синим); буквой Б – фермент-субстратный комплекс (глицилтирозин, субстрат, изображен красным). На рисунке показана только часть молекулы фермента