Биотехнологии 2015 Сборник материалов международного конгресса

PLENARY SESSION | | FUNDAMENTAL RESEARCHES AND BIOTECHNOLOGY

ханизмов устойчивости к бета-лактамам является синтез ферментов бета-лактамаз, гидролизующих бета-лактамное кольцо антибиотика. По своей структуре и субстратной специфичности они разделяются на несколько молекулярных классов, которые далее разделяются на группы и подгруппы. Бета-лактамазы характеризуются высокой мутабельностью, что является следствием общебиологического механизма адаптации микроорганизмов к действию антибиотиков.

В докладе будут представлены подходы к преодолению резистентности, связанные с поиском новых ингибиторов. Существующие ингибиторы бета-лактамаз обладают довольно узкой специфичностью. Новый подход состоит в анализе структурных особенностей ферментов и поиске поверхностных центров регуляции их активности.

Также будут представлены результаты разработки и использования олигонуклеотидных микрочипов на различных носителях для идентификации генетических детерминант резистентности, относящихся к наиболее распространенным генам бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) и карбапенемаз.

BACTERIALRESISTANCE TOANTIBIOTICSAND WAYS TO OVERCOME IT EgorovA.M.1,2, Rubtsova M.Yu.1, Grigorenko V.G.1

1Chemistry Faculty, M.V.Lomonosov Moscow State University, Moscow

2Russian Medical Academy of Postgraduate Education, Moscow

Increase in the number of infectious diseases caused by pathogenic bacteria, is an acute problem for the whole world, both developed and developing countries. They are often caused by antibioticresistant pathogens. Investigation of mechanisms of resistance to antibiotics is an important issue of modern microbiology.

Currently, the most commonly used antibiotics are beta-lactams, whose mechanism of action is to inhibit penicillin-binding proteins, and it breacks the cell wall synthesis. The most common mechanisms of resistance to beta-lactams is the synthesis of enzymes beta-lactamases that hydrolyze the beta-lactam ring of the antibiotic. According to its structure and substrate specificity, they are divided into several molecular classes which are further divided into different groups and subgroups. Betalactamases are highly mutable, which is a consequence of general biological mechanism of adaptation of microorganisms to antibiotics.

Novel approaches to overcoming resistance associated with the search for new inhibitors will be presented. Existing beta-lactamase inhibitors have quite a narrow specificity. The new approach consists in the analysis of the structural features of enzymes and finding surface centers of regulation of their activity.

The results of the development and validation of oligonucleotide microarrays on different supports for the identification of the genetic determinants of resistance related to the most common beta- lactamases of extended spectrum (ESBL) and carbapenemases will be also presented.

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	19

ПЛЕНАРНОЕ ЗАСЕДАНИЕ | | ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ

УДК 613.2:57.085

ПРОБЛЕМЫ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ: ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ И КОНТРОЛЬ Тутельян В.А.

ФГБНУ «НИИ питания», 109240, Москва, Устьинский проезд, 2/14 e-mail: [e-mail]

Обсуждаются основные направления использования биотехнологий, система оценки безопасности на этапе государственной регистрации новых линий ГМО в Российской Федерации, результаты контроля за оборотом ГМО на российском продовольственном рынке, проблемы контроля за новыми линиями ГМО.

Ключевые слова: генно-инженерно-модифицированные организмы, гмо, подходы к оценке безопасности ГМО, контроль за ГМО

Внастоящее время в Российской Федерации применение высоких современных технологий,

вчастности, биотехнологии, в области создания продовольственной базы страны, является одним из государственных приоритетов. Целью развития биотехнологий является выход России на лидирующие позиции в области разработки биотехнологий, в том числе по отдельным направлениям биомедицины, агробиотехнологий, промышленной биотехнологии и биоэнергетики, и создание глобально конкурентоспособного сектора биоэкономики, который наряду с наноиндустрией и информационными технологиями должен стать основой модернизации и построения постиндустриальной экономики.

Использование биотехнологии в сельском­ хозяйстве ориентировано на стабильное развитие производства, получение высококачественных пищевых продуктов, решение проблем продовольственной безопасности, переработку отходов производства, восстановление плодородия почв.

За период с 1996 по 2014 гг. мировые площади посевов ГМ культур возросли более чем в 100 раз, достигнув 181,5 млн. га. В 2014 году ГМ культуры выращивали 28 стран, в том числе – 5 стран Европейского Союза. На национальном уровне системы оценки качества и безопасности ГМО созданы в 65 странах (37+28 стран ЕС) и с 1996 по 2014 год в разных странах было выдано 3083 разрешений на 357 линий ГМО (1458 разрешений – на пищевое использование, 958 – на использование при производстве кормов, 667 – на выращивание). Таким образом, доказательная база безопасности ГМО, представленных в настоящее время на мировом рынке, содержит исчерпывающие сведения [http://www.isaaa.org/].

Разработка системы оценки безопасности ГМО, действующей в Российской Федерации, была начата в 1995–1996 г.г. Данная система не только аккумулирует весь отечественный и

зарубежный опыт, но и включает новейшие научные подходы, основанные на достижениях со -

временной фундаментальной науки: геномный и протеомный анализ, выявление повреждений

ДНК и мутагенной активности, выявление продуктов свободнорадикальной модификации ДНК

и других чувствительных биомаркеров.

Российская система оценки безопасности ГМО в настоящее время является одной из самых

строгих в мире. Начиная с момента формирования, российская система оценки безопасности

ГМО включала обязательное проведение хронического токсикологического эксперимента дли-

тельностью не менее 180 дней, – такой подход был принят Европейским Союзом начиная с 2004

г., причем в ЕС длительность исследований составляет лишь 90 дней; начиная с 2011 г. оценка безопасности новых линий ГМО в рамках процедуры их государственной регистрации в России

20	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

PLENARY SESSION | | FUNDAMENTAL RESEARCHES AND BIOTECHNOLOGY

включает также проведение исследований репродуктивной токсичности в экспериментах на поколениях животных.

Всоответствии с действующей в России системой оценки безопасности ГМО растительного происхождения, 20 линий ГМО прошли полный цикл медико-биологических исследований за период с 1999 по 2015 г.г. (в экспериментах было использовано более 17 000 лабораторных животных, проведено более 160 000 анализов) и разрешены для использования в питании населения Российской Федерации.

Решение о государственной регистрации того или иного ГМО в Российской Федерации основано на совокупности результатов комплексной медико-биологической оценки безопасности; результатов оценки безопасности, послуживших основанием для регистрации в других странах; результатов пострегистрационного мониторинга в странах, уже использующих данный ГМО в питании населения; возможности организации эффективного контроля за обращением ГМО в России.

Подход к маркировке ГМ пищевой продукции осуществляется с учетом требований российской общественности и действующих международных норм. Маркировка, введенная в 1999 г. в качестве рекомендательной меры [Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации № 13 от 08.04.99 г.], уже к 2002 г. приняла обязательный характер. Установленный ею порог снизился с 5% в 2002 г. до 0,9% в 2007 г., став нормой, гармонизованной с аналогичной в странах Европейского Союза [СанПиН 2.3.2.2227–07, ФЗ «О внесении изменений в закон Российской Федерации «О защите прав потребителей» № 234-ФЗ от 25.10. 2007 г., Технический регламент ТС 022/2011].

Вусловиях общемировой тенденции увеличения использования ГМО растительного происхождения, система контроля за оборотом ГМО является гарантией обеспечения необходимого уровня безопасности страны. Система контроля за оборотом ГМО на продовольственном рынке Российской Федерации разработана на основании фундаментальных исследований, проведенных РАН, РАМН, РАСХН и внедрена в практику Роспотребнадзора, агропромышленного комплекса страны, таможенной службы и других заинтересованных ведомств.

Методическая база включает самые современные методы, основанные на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР), методе гибридизации на биологическом микрочипе, ПЦР

врежиме реального времени, иммуно-флуоресцентном анализе. Только в 2003–2012 г.г. учреждениями системы Роспотребнадзора было проведено более 250 000 исследований пищевых продуктов с целью выявления ГМО.

Согласно результатам мониторинга за обращением ГМО на продовольственном рынке Российской Федерации распространенность таких продуктов за последние годы значительно снизилась: в 2003–2004 г.г., доля продукции из ГМО составляла 11–12% от всей продукции, имеющей ГМ аналоги, в 2010 году – 0,16%, в 2011 – 0,1%. Такая тенденция свидетельствует об отказе производителей от использования биотехнологического сырья, и замене полноценного растительного белка (сои) при производстве мясных и колбасных изделий на плохо усваивае -

мые соединительнотканные белки или крахмалсодержащие компоненты, что снижает пищевую ценность продуктов примерно на 20%. Принимая во внимание, что колбасные изделия тради - ционно являются существенным источником белка в структуре питания населения России (за первое полугодие 2011 г. было потреблено 1 175,3 тыс. тонн), отказ от использования биотех- нологического сырья снижает потребление полноценного белка, в результате чего сильнее на- рушается баланс белков/жиров/углеводов в рационе.

Следует принять во внимание, что в настоящее время существует определенный риск потери контроля за ГМО растительного происхождения, связанный с появлением на мировом продо- вольственном рынке ГМО 2-го поколения, которые не содержат регуляторные последователь-

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	21

ПЛЕНАРНОЕ ЗАСЕДАНИЕ | | ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ

ности (промотор 35S и терминатор NOS), на выявлении которых основана стратегия контроля за ГМО, применяемая в Российской Федерации. К началу 2015 уже более 30% ГМО растительного происхождения (среди которых соя, кукуруза, рапс, пшеница, рис, томаты, сладкий перец, баклажаны, дыня, тыква, подсолнечник, и др.) присутствующие на мировом продовольственном рынке, не содержат регуляторных последовательностей, и, следовательно, потенциально могут присутствовать на Российском продовольственном рынке и оставаться неидентифицированными в рамках рутинного контроля за оборотом ГМО. Для обнаружения и идентификации таких ГМО необходима, во-первых – информация о последовательности нуклеотидов, характерной для конкретного трансформационного события (такая информация не всегда находится в открытом доступе в сети Интернет), во-вторых – наличие стандартного образца конкретной линии ГМ растения (стандартные образцы состава и свойств производят только «The Institute for Reference Materials and Measurements» (IRMM), Европейский Союз, и «The American Oil Chemists’ Society» (AOCS), США, и для многих линий ГМО стандартные образцы не созда - ны). Существующие в Российской Федерации тест-системы для выявления ГМО в пищевых продуктах (производства «Синтол» и «Интерлабсервис»), которые Роспотребнадзор использует для осуществления контроля за ГМО, охватывают только линии, содержащие промотор 35S и терминатор NOS (скрининг), или линии, прошедшие государственную регистрацию (идентификация трансформационного события). В соответствии с порядком государственной регистрации ГМО, предназначенных для пищевого применения (МУ 2.3.2.2306–07 «Медико-биологическая оценка безопасности ГМО растительного происхождения»), заявитель представляет методы идентификации, протоколы проведения анализов, праймеры, стандартные образцы состава и свойств.

Таким образом, отказ от государственной регистрации ГМО (введение запрета на регистра - цию) приведет к практически полной невозможности контроля за биотехнологической продукцией 2-го и последующих поколений в течение ближайших 2-х лет. Только масштабная регистрация такой продукции позволит эффективно осуществлять контроль за обращением

ГМО на рынке Российской Федерации.

ISSUES OF GENETICALLY MODIFIED ORGANISMS: SAFETYASSESSMENTAND CONTROL

Tutelyan V.A.

FSBI «Institute of Nutrition», 109240, Moscow, Ust’inskii proezd, 2/14 e-mail: [e-mail]

Keywords: genetically modified organisms, GMO, safety assessment approaches, control over GMO

The main directions of biotechnology using, the system of GMO new lines safety assessment at the

stage of state registration in the Russian Federation, the results of control over the GMO circulation on the Russian food market, problems of control over the new GMO lines are discussed.

22	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

PLENARY SESSION | | FUNDAMENTAL RESEARCHES AND BIOTECHNOLOGY

Dr Thomas R. Schneider

EMBL Hamburg Unit (European Molecular Biology Laboratory, Hamburg, Germany)

Since 2012, the EMBL beamlines for macromolecular crystallography are in operation on the PETRA III synchrotron in Hamburg, Germany.

The highly-brilliant X-rays delivered by PETRA III in combination with cutting-edge experimental stations allow to determine crystal structures of biological macromolecules routinely and at high resolution.

The beamlines are embedded in the ‘Integrated Facility For Structural Biology’that provides services and expertise to external users for the entire crystal structure determination process from protein purification via crystallization and synchrotron data collection all the way to the construction of a structural model and its analysis.

We will illustrate current possibilities by discussing examples of crystal structure determinations for biotechnology and for basic biological research.

STRUCTURALBIOLOGYWITH MODERN LIGHT SOURCES

Victor Lamzin

European Molecular Biology Laboratory, c/o DESY, Hamburg, Germany

Structuralbiologyis beingboostedwithnew large-scaleinfrastructuresemergingaroundthe world, novel techniques becoming available, and the spectrum of potential applications extending to as yet unthinkable levels. Impressive advances in high-flux synchrotron and free-electron laser radiation sources revolutionise the way we can visualise biological events, dynamics and processes. It becomes now possible to decipher structure and function of many molecular machines at an atomic level of detail. Two recently launched Russian-German initiatives in structural biology will be presented that aim at advancing towards translational research in the areas of major impact to human health, such as cancer and antibiotic resistance. The emphasis will be on the research activities in the development of protocols for biological sample preparation and quality control, novel approaches for sample delivery, and computational methods for the interpretation of the experimental diffraction data.

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	23

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

SECTION “BIOTECHNOLOGYAND MEDICINE”

УСТНЫЕ ДОКЛАДЫ

ORALREPORTS

МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ ЛИЗОЦИМА И КАЗЕИНАТА НАТРИЯ Антонов Ю.А.1, Журавлева И.Л.

Институт Биохимической физики им. Н.М. Эмануэля, Российской академии наук, Ул. Косыгина. 4. 119334 Москва, Российская Федерация.

Макромолекулярные комплексы лизоцима с полиэлектролитами и полиамфалитами играют важную роль в ферментативной активности лизоцима. Однако связывание лизоцима в комплекс с другими белками, структура и состав таких комплексов изучены недостаточно. Понимание движущих сил, определяющих самоагрегацию белка и последующие стадии, приводящие к построению надмолекулярных структур, является исключительно важным для контролирования их формы, размера, активности и других свойств. В данном исследовании связывание лизоцима казеинатом натрия (КН) в водных буферных растворах (pH 7.0), морфология комплексной системы, структура комплексных частиц и стабильность структуры белка в комплексе изучены методами турбидиметрии, динамического и статического светорассеяния, оптической, конфокальной микроскопии, и электронной микроскопии, флуоресценции, и кругового дихроизма. Установлено, что морфология комплексной системы, структура, эффективный заряд и растворимость комплексных частиц зависит от отношения зарядов противоионов комплексных частиц (ОЗ), и, поэтому, от весового отношения лизоцима и КН в смеси (q), ионной силы и рН. При ОЗ<0.35, когда поверхностный заряд (ƺ) отрицателен, комплексообразование приводит к образованию относительно небольших монодисперсных частиц с гидродинамическим радиусом Rh=54 nm. При ОЗ от 0.35 до 1.0 эти частицы образуют разветвленную структуру. Максимальное связывание в комплекс имеет место при ОЗ=0.985, или q=1.2, что соответствует 26 молей лизоцима на 1 моль КН в комплексе. При относительно низком ОЗ (меньше 1) оба белка локализуются в комплексных частицах более менее равномерно, тогда как при более высоком ОЗ лизоцим формирует на переферии комплексных частиц высоко-концентрированный слой. Комплексоообразование приводит к значительной дестабилизации вторичной структуры белка в комплексе, и заметному изменению локальной третичной структуры лизоцима. Полученные комплексы могут рассматриваться как отдельный вид полиэлектролитных комплексных мицелл. Исследование имеет значение для инженерной терапии белковых наночастиц в области

биомедицины и вносит существенный вклад в понимание принципов, определяющих взаимо- действие белков.

24	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

MACROMOLECULAR COMPLEXES OF LYSOZYMEAND SODIUM CASEINATE YurijA.Antonov, and Irina L. Zhuravleva

N.M. Emanuel Institute of Biochemical Physics,

Russian Academy of Sciences, Kosigin Str. 4. 119334 Moscow, Russia

Macromolecular complexes of lysozyme with polyelectrolytes and polyampholytes play an important role in enzymatic activity of lysozyme. However binding of lysozyme in complex with other proteins, structure and compositions of such complexes studied unsufficiently. Understanding the driving forces that trigger protein self-assembly and the successive steps leading to the building of supramolecular structures is of paramount importance for controlling their shape, size, activity and other properties. In present study binding of lysozyme bycaseinate (SC) in aqueous buffered solutions (pH 7.0), morphology of the complex system, structure of the complex particles, as well as structural stability of the proteins within the complex were investigated by several techniques, including turbidimetry, dynamic and static light scattering (DLS and SLS), optical, confocal and enviropment scanning electron microscopies, fluorescence, circular dishroism spectroscopy. The solution behavior, morphology of the complex system, structure, and effective charge of the formed complexes proved to be dependent on the [Cat+]/[An-] charge ratio (ChR) of complex particles, and, therefore, by the lysozyme/ caseinate ratio (q), ionic strength (I) and pH.At the ChR < 0.35, when the surface charge ( ƺ) is negative, complexation leads to formation of a relatively small monodisperse spherical complex particles with the hydrodynamic radius Rh=54 nm. These particles form branch structure at the ChR from0.35 to1. The maximal binding of lysozyme with SC in complex take place at the ChR =0.985 or q=1.2, that correspond to 26:1 mole lysozyme/mole of SC.At a relatively low ChR (below 1.0) both proteins distributed more less uniformly within complex particles, whereas at a higher ChR, lysozyme form high concentrated layer on periphery of the complex particles. Complexation leads to considerable destabilization secondary structure of both proteins within complex and an appreciable changes in the local tertiary structure of lysozyme. The obtained protein complex can be viewed as a kind of special polyelectrolyte complex micelle. Our present work may have implications for the nanoparticle protein engineering therapy in the biomedicine field and may provide a better understanding of the principles governing the protein–protein interactions.

УДК 621.039.75

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЕВИТАЛИЗИРОВАННОГО ПЕРИКАРДА В КАЧЕСТВЕ ПЛАСТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ КАРДИОХИРУРГИИ Бритиков Д.В., Муратов Р.М., Цыганков Ю.M., Серов Р.А., Городков А.Ю.

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научный центр сердечно-сосудистой хирургии имени А.Н. Бакулева»,

Москва, Россия 121552, Рублевское шоссе, 135. e-mail: [e-mail]

Разрабатываются образцы биоматериала для замещения дефектов перикарда, пластики де- фектов при врожденных пороках сердца. Наилучший результат показывает аллогенный пери- кард, обработанный методами тканевой инженерии с использованием ЭДТА и дигитонина. Ключевые слова: аллогенный перикард, ксеноперикард, девитализация, глутаровый альде- гид, биосовместимость.

Цель работы. Экспериментальная оценка использования девитализированного метода- ми тканевой инженерии перикарда в качестве пластического материала в кардиохирургии.

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	25

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

Материал и методы исследования. Материал – ксеноперикардиальные пластины и пластины из глиссоновой капсулы. Обработка – ГА, ЭДТА и дигитонин, дезоксихолат натрия. Методы исследования –подкожнаяимплантациякрысам,наложениеобразцовбиоматериаловнаперикард, гистологическое исследование. Упруго-прочностные свойства определялись на разрывной машине. Результаты. Обработка ДОА вызвала выраженную воспалительную реакцию на пересаженный материал. Образцы, девитализированные ЭДТА и дигитонином оказались инертными и отторжения не вызывали. Контрольные образцы ксеноперикарда и глиссоновой капсулы печени показали утолщение с развитием выраженного процесса инкапсуляции. Упруго-прочностные свойства не ухудшались. Выводы. Девитализация ЭДТА и дигитонином позволяет получить биосовместимые пленки, которые могут использоваться в кардиохирургии. Обработка дезоксихолевой кислотой сохраняет остаточную токсичность. Обработка ГА ксеноперикарда и глиссоновой капсулы показала фиброз и инкапсуляцию.

1.  Патент RU (11) 2291675 (13) C2, 20.01.2007.

2.  Бритиков Д.В.Криосохраненные аллографты для сердечно-сосудистой хирургии: дис....

докт. мед. наук. – М, 2004.— 250 с.

UDC 621.039.75

EXPERIMENTALEVALUATION OF USAGE DECELLULARIZED PERICARDIUMAS APLASTIC MATERIALFOR CARDIOVASCULAR SURGERY

Britikov D.V., Muratov R.M., Tsygankov Y.M., Serov, R.A., GorodkovA.Y.

Federal state budget scientific center “Scientific center for cardiovascular surgery named A.N. Bakulev”, Moscow, Russia

121552, Rublyovskoye highway 135. Е-mail: [e-mail]

Samples of biomaterial developed for replacement of defects of the pericardium, surgical treatment of congenital heart diseases. The best result shows allogeneic pericardium treated by the methods of tissue engineering using EDTA and digitonin.

Keywords: allogeneic pericardium, bovine pericardium, bovine Glisson capsule, decellularization, glutaric aldehyde, biocompatibility.

The purpose of the work. Experimental evaluation usage decellularized pericardium by tissue engineering methods as a plastic material surgery.

Material and methods. Material – allogeneic pericardial and bovine pericardial plates and plates of bovine Glisson capsules. Treatment – glutaric aldehyde, EDTA, digitonin, sodium deoxycholate. Research methods – subcutaneous implantation in rats, the imposition of samples of biomaterials on the pericardium, histological examination. Mechanical propertieswere determinedon a tensile test- ing machine. Results. Treatment of sodium deoxycholate caused apronounced inflammatory response in the transplanted material. Samples decellularized EDTAand digitonin was inert and rejection is not caused. Control samples of bovine pericardial and bovine Glisson capsules showed thickening with the development of an explicit process of encapsulation. Elastic-strength properties are not deterio- rated. The conclusions. Decellularization of EDTAand digitonin allows obtaining biocompatible film that can be used in cardiac surgery. Sodium deoxycholate treatment retains residual toxicity. Glutaric

aldehyde treatment of bovine pericardial and glisson capsule showed fibrosis and encapsulation.

1.  Patent RU (11) 2291675 (13) C2, 20.01.2007.

2.  Britikov D.V.Kryopreserved allografts for cardiovascular surgery: dis....prof. of medical sci- ences. – M., 2004. – 250 p.

26 Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND MEDICINE”

МЕТОДЫ СКАНИРУЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ МИКРОСКОПИИ И СПЕКТРОСКОПИИ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОЙ ДИАГНОСТИКИ Быков В.А.

Группа предприятий «НТ-МДТ», ФГУП НИИФП им. Ф.В. Лукина, кафедра микроэлектроники ФФКЭ МФТИ, Зеленоград, Москва e.mail: [e-mail]

До последнего времени СЗМ относилась к числу эксклюзивных методов, требующих как для получения данных, так и для их интерпретации специальных знаний и навыков, что сдер - живает широкое распространение метода. Это имеет особенно большое значение для примене - ния методов СЗМ в медицине, где необходимо дать инструменты, позволяющие медицинскому персоналу, как правило, не обладающему необходимым естественнонаучным и инженерным образованием оперативно производить необходимые исследования.

В последние годы как у нас в стране, так и за рубежом [1–3] проведены исследования, показывающие перспективность применения методов атомно-силовой микроскопии в диагностики рака. Показано, что жесткость клеток, обусловлена структурой актинового скелета для здоро - вых и опухолевых клеток значительно различается. При этом модуль Юнга может меняться в диапазоне 50–80% – опухолевые клетки значительно более мягкие. Более того, показано, что при обработке трипсином модуль Юнга нормальных клеток снижается (на 70%), а опухолевых возрастает (на 70%), что, при измерениях модуля Юнга в жидкостных ячейках позволяет значительно повысить достоверность диагностики [1].

С целью облегчить измерения топографии, вязкоупругих свойств, включая быстрое и эффективное измерение модуля Юнга одновременно с топографическими измерениями разработан новых контроллер, создан и интегрирован в программное новый метод сканирующей зондовой микроскопии “HybriD”, позволяющий одновременно измерять рельеф, модули упругости, распределение сил адгезии, работы сил адгезии, вязкоупругие и электрические свойства поверх - ностных структур.

Появилась возможность работать как с отдельными, в том числе специализированными кантилеверами, так и использовать кантилеверный картридж, представляет собой многозондовый датчик контурного типа, содержащий 38 кантилеверов. Выбор действующего кантилевера осуществляется программно с оптическим контролем. Замена картриджа осуществляется вручную и не является сложной процедурой. Для работы с картриджами созданы специальные измерительные головки, которые интегрируются в новые приборы компании.

Для прецизионного качественного анализа создаются приборы линии ИНТЕГРА-СПЕКТРА, позволяющие работать в режимах Рамановской и ИК-спектроскопий нанометрового разрешения в комбинации с атомно-силовой микроскопией.

Литература:

1.  Ефремов Ю.М., диссертация на соискание ученой степени к.б.н.: Исследование меха- нических свойств клеток и структуры цитоскелета методами атомно-силовой микроскопии. Биофак МГУ, декабрь, 2014 год;

2.  Yu.M. Efremov, M.E. Lomakina, D.V. Bagrov, P.I. Makhnovskiy, A.Y. Alexandrova, M.P. Kirpichnikov, K.V. Shaitan Mechanical properties of fibroblasts depend on level of cancer trans- formation// Biochimica et biophysica acta V. 1843 (5), p. 1013–1019. – 2014.

3.  Swaminathan V. и др. Mechanical stiffness grades metastatic potential in patient tumor cells and in cancer cell lines // Cancer Res. 2011. Т. 71. № 15. С. 5075–5080.

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	27

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА»

METHODS OF SCANNING PROBE MICROSCOPYAND SPECTROSCOPY FOR MEDICAL DIAGNOSTICS

V.A. Bykov

NT-MDT Co., NIIFP named after F.V. Lukin, Microelectronics subdepartment of Faculty of Physical and Quantum Electronics in MIPT, Zelenograd, Moscow

e-mail: [e-mail]

Until very recently, Scanning Probe Microscopy (SPM) has been a quite complicated technique that required high-level skills and knowledge both in data acquisition and in their interpretation. This significantly limited SPM in its use on the regular basis. An important area suffering from this complication is medicine that requires instruments of near real-time analysis for personnel not educated in engineering or science.

For recent years, a number of studies in Russia and worldwide [1–3] demonstrated promising prospects of the Atomic Force Microscopy methods in applications related to cancer diagnostics. It was shown that cell stiffness due to the structure of the actin skeleton is considerably different for normal and tumor cells. The Young’s modulus of the cells can vary in the range of 50–80%, with the tumor cells being much softer. Moreover, treatment by trypsin provides change of the Young’s modulus reducing it for normal cells (by 70%) and increasing for tumor increases (by 70%), thus allowing for significantly improved accuracy of diagnosis by data collected by measurements of the Young’s modulus in liquid cells [1].

To facilitate measurements of topography and viscoelastic properties (including rapid and efficient measurement of young’s modulus simultaneously with topographic measurements), a new dedicated controller has been developed, and the instrumentation software has been extended with a new Scanning Probe Microscopy mode (called “HybriD”) capable to measure simultaneously topography, modules of elasticity, adhesion force distribution, adhesion work distribution, and a number of viscoelastic and electrical properties of surface structures.

This offers the opportunity to operate both with individual (including dedicated) cantilever and with a cantilever cartridge, which is a multi-probe sensor of contour type containing 38 cantilevers. A cantilever to operate is selected by a control program using optical feedback. A cartridge can be exchanged manually through a simple procedure. The cartridges are insertion devices for newly developed measuring heads, which integrate in the latest instruments of our Company.

For precise qualitative analysis, the instruments of the NTEGRA-SPECTRUM series are developed and customized to operate in the Raman and IR spectroscopy modes of nanometer resolution in combination with the atomic force microscopy.

REFERENCES:

1.  Yu.M. Efremov, Ph. D. thesis in Biology, Investigation of mechanical properties of cells and the structure of the cytoskeleton by atomic force microscopy. Faculty of Biology, Moscow State University, December, 2014.

2.  Yu.M. Efremov, M.E. Lomakina, D.V. Bagrov, P.I. Makhnovskiy, A.Y. Alexandrova,

M.P. Kirpichnikov, K.V. Shaitan Mechanical properties of fibroblasts depend on level of cancer trans-

formation// Biochimica et biophysica acta V. 1843 (5), p. 1013–1019. – 2014.

3.  Swaminathan V. и др. Mechanical stiffness grades metastatic potential in patient tumor cells and in cancer cell lines // Cancer Res. 71 (15), p. 5075–5080 – 2011.

28	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015