- •Національна академія наук україни
- •Перелік умовних скорочень
- •Розділ 1 огляд літератури
- •1.2. Способи отримання цільових амінокислот
- •1.3. Продуценти лізину та треоніну
- •1.4. Регулювання та шляхи інтенсифікації біосинтезу лізину та треоніну
- •Розділ 2 матеріали і методи досліджень
- •2.1. Штами-продуценти
- •2.2. Умови культивування та поживні середовища
- •2.3. Дослідження ауксотрофності
- •2.4. Дослідження впливу мутагенних факторів на штами-продуценти лізину та треоніну
- •2.5. Філогенетичний аналіз
- •2.6. Біохімічні та фізичні методи аналізу
- •2.7. Статистичне оброблення експериментальних результатів
- •Розділ 3 клоновий аналіз штамів-продуцентів лізину та треоніну
- •3.1. Проведення клонового аналізу штамів-продуцентів лізину
- •Біосинтез лізину штамами Brevibacterium
- •Накопичення лізину клонами штамів Brevibacterium на 60 годину культивування на ензиматичному мелясному середовищі
- •3.2. Дослідження ауксотрофності штамів-продуцентів лізину
- •Визначення ауксотрофності клонів Brevibacterium на твердому мс з сахарозою
- •Вплив амінокислот аспартатної родини на біосинтез лізину клонами
- •3.3. Визначення ауксотрофності штаму-продуценту треоніну
- •Визначення ауксотрофності у b. Flavum тн7
- •Розділ 4 отримання мутантних штамів-продуцентів лізину та треоніну
- •4.1. Вплив уф-опромінення на штами-продуценти лізину
- •Утворення мутантних штамів під дією уф
- •Чутливість вихідних та мутантних штамів до антибіотиків
- •Синтез цільової амінокислоти та коефіцієнти конверсії джерел живлення
- •4.2. Вплив хімічного мутагенезу (ntg) на штами-продуценти
- •4.3. Здійснення уф-мутагенезу штаму-продуценту треоніну
- •Утворення мутантних штамів b. Flavum тн7 під дією уф
- •Чутливість вихідного та мутантних штамів до антибіотиків
- •4.4. Характеристика мутантного штаму-продуценту лізину Brevibacterium sp. Imb b-7447
- •4.5. Характеристика мутантного штаму-продуценту треоніну Brevibacterium flavum iмв в-7446
- •4.6.Порівняння послідовностей гена 16s рРнк у різних штамів-продуцентів лізину
- •4.7. Порівняння послідовностей гена 16s рРнк у різних штамів-продуцентів треоніну
- •Розділ 5 оптимізація умов культивування мутантних штамів-продуцентів лізину та треоніну
- •5.1. Оптимізація умов культивування мутантного штаму-продуценту лізину
- •5.2. Оптимізація умов культивування мутантного штаму-продуценту треоніну
- •Вплив ростових факторів на синтез треоніну
- •Синтез треоніну на середовищі з різним вмістом амінокислот
- •Синтез треоніну штамом b. Flavum iмв в-7446
- •Розділ 5 узагальнення отриманих результатів
- •Висновки
- •Список використаної літератури
- •Паспортизація штаму-продуценту треоніну
- •Паспортизація штаму-продуценту лізину Brevibacterium sp. Imb b-7447
2.7. Статистичне оброблення експериментальних результатів
Статистичну обробку даних здійснювали за допомогою програми Microsoft Excel. Усі досліди проводили в 3 повтореннях. Різницю між двома середніми величинами вважали вірогідною при р<0,05 [179].
Розділ 3 клоновий аналіз штамів-продуцентів лізину та треоніну
Проведення клонового аналізу здійснювали для виявлення спонтанних мутацій мікроорганізмів після тривалого зберігання культур. Спонтанні мутації виникають протягом життя клітин в нормальних для них умовах навколишнього середовища. Причинами спонтанних мутацій можуть бути порушення при діленні ДНК, перебудова хромосом, зміна послідовності нуклеотидів в ДНК та перебудова генів. Спонтанні мутації є елементарним еволюційним явищем та найважливішим джерелом спадкових змін. Такі мутації можуть слугувати матеріалом для природного відбору.
3.1. Проведення клонового аналізу штамів-продуцентів лізину
Дослідження проводили для отримання високопродуктивних штамів-продуцентів амінокислот – лізину та треоніну. Об'єктами дослідження були культури Brevibacterium sp. 90 Н, Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. Е531 та B. flavum TH7. Для визначення кількості синтезованого лізину штами культивували штами в періодичних умовах протягом 72 годин на середовищі з мелясою для визначення кількості синтезованого лізину.
Представлені у табл. 3.1 результати щодо накопичення біомаси, зміни рН середовища, використання СР свідчать про споживання поживних речовин середовища та утворення лізину.
Додавання лейцину у ензиматичне мелясне середовище не впливало на біосинтетичну активність штамів, хоча за паспортами ці культури були ауксотрофами за лейцином. Тому в подальших дослідженнях обов'язково проводили перевірку ауксотрофності штамів.
Для виявлення штамів з підвищеною продуктивністю за цільовою амінокислотою було проведено культивування Brevibacterium sp. 90Н, Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. Е531 та B. flavum TH7та здійснено перевірку ауксотрофності штамів щодо лейцину та інших амінокислот аспартатної родини.Після кожної ферментації культуральну рідину розсівали в чашки Петрі із збагаченим поживним середовищем, основним компонентом якого був МПБ. Виявлено, що поряд з типовими колоніями Brevibacterium (випуклими, блискучими, жовто-лимонного кольору) існували колонії, які мали біло-сіре забарвлення. Кількісне співвідношення колоній жовто-лимонного кольору і відмінних від них за забарвленням складало 12:8. Розщеплення на два типи колоній відбулося у співвідношеннях Brevibacterium sp. Е531 – пігментованих 75%, безпігментних – 25%; Brevibacterium sp. 90Н – пігментованих 68%, безпігментних – 32%; Brevibacterium sp. 90 – пігментованих 60%, безпігментних – 40%, представлених на рис. 3.1. Штам B. flavum утворював окремі колонії тільки жовтого кольору.
На наступному етапі було здійснено перевірку отриманих клонів за кількістю накопиченого лізину. Умови культивування: періодичне культивування, температурний режим 31±10С, при 250 хв-1.
Таблиця 3.1