- •Національна академія наук україни
- •Перелік умовних скорочень
- •Розділ 1 огляд літератури
- •1.2. Способи отримання цільових амінокислот
- •1.3. Продуценти лізину та треоніну
- •1.4. Регулювання та шляхи інтенсифікації біосинтезу лізину та треоніну
- •Розділ 2 матеріали і методи досліджень
- •2.1. Штами-продуценти
- •2.2. Умови культивування та поживні середовища
- •2.3. Дослідження ауксотрофності
- •2.4. Дослідження впливу мутагенних факторів на штами-продуценти лізину та треоніну
- •2.5. Філогенетичний аналіз
- •2.6. Біохімічні та фізичні методи аналізу
- •2.7. Статистичне оброблення експериментальних результатів
- •Розділ 3 клоновий аналіз штамів-продуцентів лізину та треоніну
- •3.1. Проведення клонового аналізу штамів-продуцентів лізину
- •Біосинтез лізину штамами Brevibacterium
- •Накопичення лізину клонами штамів Brevibacterium на 60 годину культивування на ензиматичному мелясному середовищі
- •3.2. Дослідження ауксотрофності штамів-продуцентів лізину
- •Визначення ауксотрофності клонів Brevibacterium на твердому мс з сахарозою
- •Вплив амінокислот аспартатної родини на біосинтез лізину клонами
- •3.3. Визначення ауксотрофності штаму-продуценту треоніну
- •Визначення ауксотрофності у b. Flavum тн7
- •Розділ 4 отримання мутантних штамів-продуцентів лізину та треоніну
- •4.1. Вплив уф-опромінення на штами-продуценти лізину
- •Утворення мутантних штамів під дією уф
- •Чутливість вихідних та мутантних штамів до антибіотиків
- •Синтез цільової амінокислоти та коефіцієнти конверсії джерел живлення
- •4.2. Вплив хімічного мутагенезу (ntg) на штами-продуценти
- •4.3. Здійснення уф-мутагенезу штаму-продуценту треоніну
- •Утворення мутантних штамів b. Flavum тн7 під дією уф
- •Чутливість вихідного та мутантних штамів до антибіотиків
- •4.4. Характеристика мутантного штаму-продуценту лізину Brevibacterium sp. Imb b-7447
- •4.5. Характеристика мутантного штаму-продуценту треоніну Brevibacterium flavum iмв в-7446
- •4.6.Порівняння послідовностей гена 16s рРнк у різних штамів-продуцентів лізину
- •4.7. Порівняння послідовностей гена 16s рРнк у різних штамів-продуцентів треоніну
- •Розділ 5 оптимізація умов культивування мутантних штамів-продуцентів лізину та треоніну
- •5.1. Оптимізація умов культивування мутантного штаму-продуценту лізину
- •5.2. Оптимізація умов культивування мутантного штаму-продуценту треоніну
- •Вплив ростових факторів на синтез треоніну
- •Синтез треоніну на середовищі з різним вмістом амінокислот
- •Синтез треоніну штамом b. Flavum iмв в-7446
- •Розділ 5 узагальнення отриманих результатів
- •Висновки
- •Список використаної літератури
- •Паспортизація штаму-продуценту треоніну
- •Паспортизація штаму-продуценту лізину Brevibacterium sp. Imb b-7447
Вплив амінокислот аспартатної родини на біосинтез лізину клонами
Назва амінокислоти |
Показники КР, одиниці вимірювань | |||
рН |
ОГ (1:10), 440 |
Синтез лізину |
Синтез інших амінокислот | |
Контроль – МС без амінокислоти |
7,85 |
0,10 |
- |
- |
Клон №6 | ||||
Аспарагін |
7,78 |
0,20 |
- |
- |
Лізин |
6,81 |
0,44+П |
+ |
+ |
Лейцин |
6,62 |
0,50++П |
+ |
+ |
Ізолейцин |
7,73 |
0,20 |
- |
- |
Треонін |
7,28 |
0,20 |
- |
- |
Метіонін |
6,95 |
0,35++П |
+ |
+ |
Триптофан |
7,48 |
0,20 |
- |
- |
Клон №7 | ||||
Аспарагін |
7,80 |
0,14 |
- |
- |
Лізин |
6,83 |
0,42 |
+ |
+ |
Лейцин |
6,81 |
0,64+++П |
+ |
+ |
Ізолейцин |
7,00 |
0,38 |
+ |
+ |
Треонін |
6,84 |
0,40 |
+ |
+ |
Метіонін |
6,80 |
0,32 |
+ |
+ |
Триптофан |
7,20 |
0,42 |
+ |
+ |
Клон №11 | ||||
Аспарагін |
7,92 |
0,12 |
- |
- |
Лізин |
7,03 |
0,42 |
+ |
+ |
Лейцин |
7,05 |
0,40+П |
+ |
+ |
Ізолейцин |
7,33 |
0,25 |
- |
- |
Треонін |
7,01 |
0,56+П |
+ |
+ |
Метіонін |
7,00 |
0,40 |
+ |
+ |
Триптофан |
7,05 |
0,52+П |
+ |
+ |
Примітка. + – присутність амінокислоти в культуральному середовищі; - відсутність амінокислоти в культуральному середовищі; +П – жовтий пігмент.
Клон №11 був ауксотрофом за лейцином, треоніном, триптофаном, метіоніном і інтенсивно ріс на МС з цими амінокислотами. У дослідах з аспарагіном та ізолейцином при незначній зміні рН та ОГ продукцію лізину не визначали.
Найвищий рівень накопичення лізину, як правило, мав місце в ауксотрофів за гомосерином. Генетичне блокування ГД зупиняло у таких клонів синтез треоніну та дозволяло шляхом обмеження вмісту треоніну в середовищі зняти інгібування АК. Ще одним важливим наслідком повного дефекту ГД було те, що спільні попередники лізину та треоніну витрачались тільки на синтез лізину. Ауксотрофи за треоніном, необхідність в якому викликана генетичним блокуванням гомосеринкінази, продукували менше лізину та одночасно накопичували гомосерин із збереженням активності ГД.
З вищевикладеного можна зробити наступні висновки: музейні штами-продуценти лізину та треоніну під час зберігання і пересівання знизили біосинтетичну активність щодо цільової амінокислоти; продуценти дали розщеплення на два типи колоній (безпігментні та пігментовані); отримані окремі клони зберігали залежність від лейцину та набували ауксотрофності до певних амінокислот аспартатної родини.
3.3. Визначення ауксотрофності штаму-продуценту треоніну
Одним із способів одержання продуцентів треоніну з використанням бревібактерій є селекція регуляторних мутантів, у яких ГД нечутлива до треоніну. Як селективні агенти використовують аналоги треоніну, найчастіше -оксинорвалін. Мутанти B. flavum, стійкі до НВ, як правило, мали дві регуляторні мутації, що порушували ретроінгібування як ГД, так і АК. У таких штамів у середовище одночасно виділялись треонін і лізин. З дуже низькою частотою можливо виділити мутанти, у яких десенсибілізована тільки ГД.
Для одержання таких мутантів було проведено дослідження ауксотрофності штаму B. flavum ТН7. Для цього висівали штам на середовища МПАзб. (позитивний контроль) та МС (негативний контроль). Клони, які росли при позитивному контролі, не росли на МС як з глюкозою, так і з сахарозою. Результати досліджень представлені в табл. 3.5.
Як видно з даних табл. 3.5 для штаму B. flavum ТН7 не було виявлено ріст на мінімальному середовищі та інших середовищах з амінокислотами, окрім росту на середовищах з серином та лейцином, тобто штам був ауксотрофом за цими амінокислотами.
Таблиця 3.5