Утворення мутантних штамів b. Flavum тн7 під дією уф

Розведення	КУО мутантних клонів на МС+
	Лейцин	Гомосерин	β-оксинорвалін
10	0	0	0
10^2	0	0	0
10^3	(2,5±0,3)x10^-3	(2,1±0,3)x10^-3	(1,4±0,2)x10^-3
10^4	(3,3±0,2)x10^-4	(3,4±0,3)x10^-3	(1,5±0,3)x10^-4
10^5	(1,8±0,3)x10^-5	(5,2±0,2)x10^-4	(1,8±0,3)x10^-5

Вихідну культуру та отриманий мутантний штам перевіряли на чутливість до антибіотиків з метою встановлення генетичних маркерів (табл. 4.5). Серед отриманих мутантних штамів були такі, що змінили чутливість до тетрацикліну та стрептоміцину.

Таблиця 4.5

Чутливість вихідного та мутантних штамів до антибіотиків

Антибіотики	Штами-продуценти
	B. flavum	Мутантний штам-продуцент треоніну	Мутантний штам, стійкий до НВ
Азитроміцин	S	S	S
Ампіцилін	S	S	S
Цефтріаксон	S	S	S

Продовж. табл 4.5

Бензилпеніцилін	S	S	S
Гентаміцин	S	S	S
Тетрациклін	S	R	S
Стрептоміцин	S	S	R
Левоміцетин	S	S	S
Канаміцин	S	S	S

Примітка. S – чутливий до дії антибітика, R – резистентний до дії антибіотика. Контролем слугувала наявність росту культур на МПАзб. без додавання антибіотиків

З метою визначення стабільності отриманих мутантних штамів їх пересівали протягом двох місяців з інтервалом 7 діб на тверде і рідке середовище та визначали кількість накопиченого треоніну. Концентрація треоніну при пересівах була майже однаковою (від 7,85 до 7,90 г/дм³). В результаті дії УФ-опромінення на продуценти треоніну було одержано мутантний штам (зареєстрований як B. flavum IМВ В-7446), який за біосинтетичною активністю та продукуванням амінокислоти відрізнявся від вихідної культури більше, ніж в 4 рази.

4.4. Характеристика мутантного штаму-продуценту лізину Brevibacterium sp. Imb b-7447

З метою підтвердження належності отриманого за допомогою УФ опромінення штаму до роду Brevibacterium провели аналіз його первинну ідентифікацію за визначником Берджі [182].

Морфологія клітин. Клітини після 24 годин росту на МПАзб. були овальні, часто розташовані під кутом, паличковидні, розміром 0,6-2,0 х 0,2-1,0 мкм (рис. 4.6), нерухомі, аспорогеннні, грам та каталазо позитивні. Паличковидні клітини з часом могли вкорочуватися до коковидних. При фарбуванні клітин метиленовим синім проявлялись метахроматичні гранули.

Морфологія колоній. При рості клітин на МПАзб. через 3-4 доби за температури 30⁰С клітини утворювали жовті, круглі, блискучі, маслянисті колонії діаметром 3-4 мм, які не виділяли пігмент у середовище. Поверхня колоній була гладенька, форма опукла, край рівний, структура однорідна. У воді колонії давали рівномірну суспензію. Посів штрихом на середовищі МПАзб. показав через 2 доби помірний ріст, край колоній був гладенький, поверхня матова, забарвлення жовто-кремове. Посів уколом показав слабкий ріст в товщі агару, на поверхні ріст був помірним.

Рис. 4.6 Клітини мутантного штаму Brevibacterium sp. IМВ В-7447 на середовищі МПАзб. (збільшення 90х)

Фізіолого-біохімічні ознаки. Мутантний штам Brevibacterium sp. IМВ В-7447 – аероб, не розріджував желатину, засвоював азот у формі амонійних солей та сечовини і не засвоював нітратний азот. Гетеротроф. Для росту на мінімальному середовищі мав потребу у біотині, тіаміні, L – лейцині. Стійкий до аналогу лізину – S-(2-аміноетил)-цистеїну.

Відношення до джерел вуглецю. Штам асимілював глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, інозит, манніт, інозитксилозу, рамнозу, етанол, оцтову кислоту, гліцерин, дульцит, янтарну кислоту і сорбіт. Зброджував з утворенням кислот фруктозу, глюкозу та сахарозу. Не утворював кислот на лактозі, галактозі, арабінозі, рамнозі, ксилозі, етанолі, метанолі, манніті, сорбіті, гліцерині, дульциті, крохмаль не гідролізував, казеїн не розкладав, мав каталазну та уреазну активність.

Ріст штаму відбувався в діапазоні температур від 24 до 42^оС, оптимальною була температура 32±1^оС.

Ріст штаму відбувався на середовищах з рН від 6,0 до 8,0, оптимальним значенням рН було 6,8 – 7,2.

Спосіб одержання штаму: мутагенез та ступінчата селекція.

Галузь використання штаму. На мелясному середовищі штам в колбах (на качалках) був здатний накопичувати 30-40 г/дм³ лізину. Штам зберігали на середовищі МПАзб. протягом 6 місяців за температури +4 ^оС.

За результатами морфологічного та фізіолого-біохімічного аналізу культура була ідентифікована як Brevibacterium sp. [182].