Mikrobiologia_praktika

27. Развёрнутая реакция агглютинации

Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или 1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр). В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы - заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий, с которыми безопасно работать.

Развёрнутая реакция агглютинации

Ставят реакцию следующим образом. В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре.

Развёрнутая реакция агглютинации

Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: ++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости);

+++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; — - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).

За титр сыворотки принимают последнее ее разведение,

в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)

Развёрнутая реакция агглютинации

28. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

Исследуемую сыворотку смешивают с эритроцитарным диагностикумом. Контролем слежит нормальная сыворотка. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.

В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.

РПГА для определения титра антител

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют эритроциты. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок.

Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как

эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител

(серодиагностика).

Постановка. В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят - 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч.

Учет. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.

Результат РНГА. Титр антител - 1:100

29. Реакция термокольцепреципитации

•В узкую пробирку (диаметр 0,5см) наливают 0,3- 0,5мл неразведенной преципитирующей сыворотки. Пастеровской пипеткой медленно наслаивают по стенке (пробирку держат наклонно) аг в таком же объеме. Затем пробирку осторожно, что бы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении аг на сыворотку четко видна граница между двумя жидкостями. РП должна обязательно сопровождаться контролем аг и сыворотки. Результаты учитывают в зависимости от вида микроорганизма через 5-10 минут, 1-2 часа, 20-24 часа. В случае положительной реакции в случае в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым материалом появляется преципитат в виде кольца белого цвета.

30. Реакция преципитации в геле (метод Оухтерлони)

•Чашки заливают агаром, в котором вырезают несколько лунок на равном расстоянии друг от друга.

•В центральную лунку вносят сыворотку, содержащую антитела, в остальные — различные испытуемые антигены или один и тот же антиген в различных разведениях.

•При диффузии реагентов в агаровом геле в зонах оптимальных соотношений на месте встречи антигена и антител образуются мутные полосы — дуги преципитации.

Полосы преципитации между антигенами в лунках G, E и иммунной сывороткой (антителами) в лунке A.

31. Реакция связывания комплемента

Реакция протекает в две фазы.

Первая фаза - взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента.

Вторая - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антигенантитело, то гемолиз эритроцитов не наступает.

Реакция связывания комплемента

Результат опыта оценивают, отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках. Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной - при полном лизисе эритроцитов, когда жидкость интенсивно окрашена («лаковая» кровь). Степень задержки гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины осадка эритроцитов на дне (++++, +++, ++, +).