Mikrobiologia_praktika
.pdf19. Метод мембранных фильтров
•Сущность метода мембранных фильтров заключается в фильтровании определенных объемов исследуемой жидкости (или твердого вещества, разведенного в воде) через мембранные фильтры №2 или №3, на которых задерживаются бактерии. Фильтры переносят на чашки со средой Эндо, инкубируемые при t° 37°, а затем исследуют выросшие на поверхности фильтра темно-красные с металлическим блеском, розовые и прозрачные колонии. Из колоний каждого типа готовят мазки и окрашивают их по Граму. Колонии разных типов проверяют на оксидазную активность, которая должна быть отрицательной. Бесцветные и розовые колонии дополнительно засевают на полужидкую среду с глюкозой и индикатором, на которой в течение 24часовой инкубации при t° 37° должны образовываться кислота и газ. Для определения коли-индекса подсчитывают выросшие на фильтре колонии кишечной палочки и затем проводят перерасчет на 1 л, 1 кг или 1 г в зависимости от исследуемого материала.
20. Метод Эйкмана
•Первый этап (1-ый день) – делают посев на среду Эйкмана (глюкозопептонная среда – ГПС) с поплавками для сбора газа и посевы ставят в термостат (инкубируют) при 43°C на 24 часа.
•Для посева малых объёмов воды используется разведённая среда Эйкмана (1% пептон; 0,4% NaCl; 0,5% глюкоза).
•Для посева больших объёмов – концентрированная среда Эйкмана, содержащая 10-кратную концентрацию основных компонентов.
•Концентрированную среду Эйкмана используют для анализа водопроводной воды. Делают посев двух проб воды по 100 мл в колбы с 10 мл среды и десяти проб по 10 мл воды в пробирки с 1 мл среды. Таким образом, объем засеянной воды – 300 мл: 2 колбы по 100 мл и 10 пробирок по 10 мл.
•Второй этап (2-ой день) – делают пересевы на среду Эндо и РДА (розолово-дифференциальный агар) из тех колб и пробирок, где наблюдается рост. Признаки роста E. coli на среде Эйкмана - диффузное помутнение и образование газа. Посевы инкубируют при 37°C 24 часа.
20. Метод Эйкмана
•Третий этап (3-ий день) – просматривают посевы на среде Эндо и РДА. Признаки роста E. coli на среде Эндо - образование гладких колоний красного цвета, с металлическим блеском. Признаки роста E. coli на РДА - пожелтение среды, вспенивание конденсационной жидкости и разрывы в РДА.
•Проводят микроскопическое подтверждение E. coli: из подозрительных колоний делают мазки и окрашивают по Граму; под микроскопом наблюдают грам «-» мелкие палочки.
•Проводят биохимическое подтверждение E. coli - оксидазный тест на цитохромоксидазу. Если есть цитохромоксидаза - бумажка синеет в течение 1 минуты. E. coli - оксидазоотрицательная. Оксидазный тест позволяет отличить E. coli от грамотрицательных, но оксидазоположительных бактерий семейства Pseudomonadaceae.
•Если обнаруживают в мазках грам «-» мелкие палочки, которые являются оксидазоотрицательными, результат анализа считается положительным (вывод: обнаружена кишечная палочка).
21. ОМЧ и фекальное загрязнение почвы
•Для определения ОМЧ почву берут на глубине 10-15 см стерильным ножом (из разных мест не менее 10 проб) в стерильную банку. Из проб готовят навеску 30 г, которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Готовят разведения 10-3, 10-4, 10-5. Из 2-х последних разведений 0,1 мл смешивают с 40 мл 0,7% расплавленного и остуженного до 450С МПА, после чего выливают двойным слоем в чашки с 2% агаром. Инкубируют в термостате. Подсчитывают количество выросших колоний.
21. ОМЧ и фекальное загрязнение почвы
•Присутствие в почве Е. coli и Streptococcus faecalis указывает на свежее; Citrobacter и Enterobacter – не свежее, a Clostridium perfringens – на давнее загрязнение. Более точная оценка – с помощью определения колииндекса (кол-во БГКП в 1 г почвы), перфрингенститра (масса почвы, в которой обнаружена особь вида Cl.perfringens), общей численности сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1 г почвы.
22. Метод стандартных дисков
•Заселение культуры газоном на агар в чашке Петри
•Диски с антибиотиком
•Инкубация 24 ч. 37 градусов
•Зоны подавления роста:
<15 мм – слабая чувствительность 15-25 мм – средняя чувситвительность >25 мм – высокая чувствительность нет – нет чувствительности
23. Метод серийных разведений
•Помещают антибиотик в бульон
•Посев культуры
•Инкубация 24 часа при температуре 37 градусов
Если бульон мутный – нужно повысить концентрацию антибиотика и повторить.
МПК – наименьшая концентрация для подавления роста
МБК – наименьшая концентрация для гибели культуры. Определяется по заселению в прозрачный бульон с разными концентрациями, где помутнения нет после первого опыта – концентрация = МБК.
24. Факторы патогенности Плазмокоагулаза
Взвесь культуры добавляют в плазму. Образование осадка говорит о наличии плазмокоагулазы, т.к. произошло свёртывание плазмы.
Гиалуронидаза
В пробирку с экстрактом пупочного канатика добавляют чистую культуру и инкубируют 15-20 минут. Затем добавляют ледяную уксусную кислоту. Если гиалуронидаза есть, ткань пупочного канатика будет разрушена, поэтому содержимое пробирки будет прозрачным. Иначе будут наблюдаться муциновые (слизистые) сгустки.
Лецитиназа
Производят посев культуры на желточносолевой агар (ЖСА).
Лецитиназа разлагает желток, поэтому вокруг культур лецитиназоположительных микроорганизмов будет наблюдаться просветление среды в виде радужного венчика.