Mikrobiologia_praktika

Полимеразная цепная реакция

Учёт реакции проводят с помощью электрофореза в агарозном геле. Отрицательно заряженные молекулы ДНК движутся в геле под действием электрического поля от катода к аноду, при этом длина пробега фрагментов ДНК за определенный промежуток времени зависит от их размера. ДНК в геле окрашивают бромидом этидия, что делает ее видимой в ультрафиолетовом свете. Если в исследуемой пробе в результате ПЦР накопились ампликоны (фрагменты ДНК одинакового размера), то они окажутся на одном расстоянии от старта и будут видны как полоса на гелевой дорожке. Если положение полосы на гелевой дорожке соответствует расчётной для использованной пары праймеров, т.е. находится на том же расстоянии от старта, что полоса положительного контроля, то это означает, что результат исследования положительный.

Полимеразная цепная реакция

Как и в каждом эксперименте при учёте результатов ПЦР предусматривают контроли – положительный и отрицательный. Любая диагностическая тест-система должна иметь утверждённый регламент, который включает наличие упомянутых контролей.

•Положительный контроль – это образец с ДНКматрицей для накапливания специфического ампликона, соответствующего определяемому микроорганизму.

•Отрицательный контроль - вода, ДНК человека или ДНК микроорганизмов, близкородственных определяемому данной тест-системой.

34. Реакция нейтрализации

Реакции нейтрализации (РН) основаны на способности АТ связывать различные возбудители или их метаболиты, лишая тем самым их возможности реализовать свои биологические свойства (иными словами, АТ нейтрализуют возбудителей). На практике РН применяют для выявления вирусов и различных токсинов. В определенной степени к ним же относят реакции торможения вирусиндуцированной гемагглютинации и иммобилизации.

Реакция нейтрализации вирусов

В сыворотки крови переболевших лиц циркулируют антитела, нейтрализующие вирусы. Их наличие выявляют смешиванием культуры возбудителей с сывороткой с последующим введение лабораторному животному или заражением культуры клеток.

На эффективность нейтрализации указывает выживание животного либо отсутствие гибели клеток в культурах.

Реакция биологической нейтрализации (РБН)

35. Реакция торможения гемагглютинации

Принцип реакции основан на способности АТ связывать различные вирусы и нейтрализовать их, лишая возможности агглютинировать эритроциты. Визуально этот эффект и проявляется в «торможении» гемагглютинации. РТГА применяют при диагностике вирусных инфекций для выявления специфических антигемагглютининов и идентификации различных вирусов по их гемагглютининам, проявляющим свойства Аг.

Реакция торможения гемагглютинации

Типирование вируса проводят в реакции РТГА с набором типоспецифических сывороток. Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации. Подтипы вируса типа А с антигенами H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 и другие могут быть дифференцированы в РТГА с набором гомологичных типоспецифических сывороток.

Результаты РТГА при типировании вируса гриппа

Исследуемый материал содержит вирус гриппа тип А с антигеном H3N2

Условные обозначения: - торможение гемагглютинации (пуговка) ; - гемагглютинация (зонтик).

Реакция торможения гемагглютинации

Определение титра антител крови больного по РТГА

Развернутая РТГА проводится в лунках пластмассовых пластин. В лунках готовят 2-х кратные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,25 мл, добавляют по 0,25 взвеси вируса в рабочем разведении и инкубируют 2 ч при температуре 37°С. Затем добавляют по 0,5 мл 1% взвеси куриных эритроцитов, инкубируют еще 2 ч и оценивают результат по феномену гемагглютинации.

При положительной РТГА образуется плотный осадок эритроцитов на дне лунки в виде диска или кольца с ровными краями. Титр антител определяют по последней лунке с положительной РТГА.

Выводы: титр антител равен 1:40

36. Радиоиммунный анализ

•Аг или ат для РИА метят радиоизотопом. Чаще всего 125I. Реакция РИА очень чувствительна, позволяет определить 1-2нг и меньше исследуемого материала.

•Чаще всего применяется радиофазная модификация РИА (суть такая же, как и ИФА). Применяют три метода твердофазной РИА: конкурентный, обратный и непрямой.

•При конкурентном методе на поверхности сорбента сорбируют известные ат. Затем в лунки вносят исследуемый аг и спустя определенное время, достаточное для специфического взаимодействия, добавляют меченый радиоизотопом очищенный аг той же специфичности.

•Если в исследуемом материале содержится аг, соответствующий иммобилизированым ат, чатсь активных центров последних блокируется. В таком случае внесенный в лунки меченый аг будет в меньшей степени (в сравнении с контролем) соединяться с ат, о чем можно судить по радиоактивной жидкой части реагирующей смеси.

36. Радиоиммунный анализ

•При проведении РИА обратным методом на поверхности лунок сорбируют очищенный немеченый аг, гомологичный исследуемому аг. В отдельной пробирке соединяют антигенсодержащий материал с меченвми ат, специфичными с аг, иммобилизированными в лунках. Если в исслудемомо материале модержится аг, способный взаимодействовать и мечеными ат, активные центры последних полностью или частично блокируются. В таком случае при внесении в лунки с аг смеси, меченые ат буду не полностью взаимодействовать с аг, о чем можно судить по степени радиоактивности жидкости в сравнении с контролем.

36. Радиоиммунный анализ

•Наиболее удобным является непрямой метод РИА с использованием антивидовых меченых ат. Метод может использован для идентификации неизвестных аг и ат. В обоих случаях применят антивидовую сыворотку, содержащих ат против соответствующих гаммаглобулинов.

•Для проведения этого метода на поверхности лунок сорбируют аг, а затем добавляют разведенную сыворотку больного. При наличии в ней соответствующих ат на поверхности лунок формируется комплекс ат-аг. При последующем введении в лунку антивидовой меченой сыворотки ат, содержащиеся в ней, адсорбируются на образовавшемся комлексе. Чем больше в сыворотке больного ат, тем больше удет связанной с поверхностью лунок радиоактивной метки.