Иммуноморфоцитохимическая характеристика острых лейкозов (классификация fab).

Исследование природы физиологических и патологических процессов на клеточном уровне наиболее надежно может быть осуществлено на основе применения цитохимических методов позволяющих дифференцированно изучить в мазках крови, костного мозга и отпечатках лимфатических узлов отдельные клетки различных ростков кроветворения. Цитохимическое выявление специфически реагирующих клеточных компонентов на внут­риклеточном уровне дает информацию, дополняющую результаты исследований с применением традиционных методов морфологи­ческой окраски и углубляет познание о структуре и функции клетки. Все большее диагностическое значение приобретают морфоцитохимические исследования в клинической и экспериментальной онкологии. Последнее десятилетие внимание исследова­телей направлено на унификацию морфоцитохимической классификации острых лейкозов (ОЛ), являющихся частью общей проблемы злокачественных новообразований.

Современная классификация лейкозов основывается на клоновой теории их патогенеза и на представлении о том, что каждая опухоль имеет своего "нормального" предшественника. Среди различных классификаций ОЛ наибольшее признание получила классификация франко-американо-британской группы (FAB), согласно которой при миелогенных ОЛ выделяют 6 типов бластных клеток. М₁, М₂, М₃ — преимущественно гранулоцитарная дифференцировка клеток, различающаяся степенью цитоплазматической "зрелости": М₁ — миелобластный лейкоз без зернистости, М₂ — миелобластный лейкоз с созреванием, М₃ — промиелоцитарный лейкоз с гипергрануляцией; М₄ и М₅ — пре­имущественно моноцитарная дифференцировка лейкозных клеток: М₄ — острый моноцитарный лейкоз; М₅ — острый монобластный лейкоз; М₆— острый эритролейкоз (эритробластная диф­ференциация). Среди острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ) выделено 3 типа: L₁ — ОЛЛ, встречающийся у детей, L₂ — ОЛЛ взрослых и L₃ — редкие случаи ОЛЛ с бластными элементами, морфологически напоминающие лимфому Беркитта. При попытке связать морфологические особенности бластных клеток согласно классификации FAB с прогнозом течения заболевания обнаружена большая продолжите0льность жизни больных с более дифференцированным типом клеток, хотя различия в продолжительности жизни были не столь значительны. Ряд исследований показал, что наличие палочек Ауэра в бластных клет­ках является неблагоприятным прогностическим признаком. Однако, другие исследования не подтвердили такой зависимости. В последние годы делаются также попытки прогнозирования течения ОЛ по данным не только морфологических, но и цитохимических исследований бластных клеток. Так, установлена коррелляция повышения содержания липидов, гликогена и высокой активности миелопероксидазы с неблагоприятным прогнозом при остром миелобластном лейкозе (ОМЛ); а повышенной активности кислой фосфатазы и b- глюкуронидазы в бластных клетках при ОЛ с более злокачественным течением. Несмотря на то, что су­ществуют определенные морфологические критерии идентификации бластных клеток, характерных для основных вариантов ОЛ, последние присутствуют далеко не всегда и часто крайне изменены по сравнению с нормальными аналогами этих клеток. Таким образом, цитохимическим исследованиям бластных клеток костного мозга и периферической крови придается большое значение при установлении цитологического варианта ОЛ, что важно для выбора современной терапевтической тактики. Все это свидетельствует о необходимости использования стабильных тестов для выявления вариантов ОЛ, какими и являются цитохимические исследования. Кроме того, при помощи этих методов можно уловить ранние особенности метаболизма клеток, имею­щих различную направленность дифференцировки, но еще не обладающих отличительной морфологической характеристикой. Для морфоцитохимической диагностики каждого варианта ОЛ в соответствии с доминирующим фенотипом лейкозных клеток выделяют цитологические субварианты.

Острый миелобластный лейкоз (М₁ и М₂ по классификации FAB). У 84% больных количество бластных клеток в гемограмме составляет 50—60%, а в костном мозге— 80—90%. Властные клетки средних размеров, с невысоким ядерно-цитоплазматическим отношением, нежной структурой ядра, содержащего от одной до нескольких нуклеол. Цитоплазма клеток серо-голубая, с просветленной перинуклеарной зоной, с азурофильными гранулами (иног­да и без них), в отдельных случаях встречаются палочки Ауэра. В случаях ОМЛ без азурофильной зернистости в цитоплазме бластных клеток, как правило,. цитохимически менее активных (часть с отрицательными реакциями на миелопероксидазу, хлорацетатэстеразу, полисахариды). В большинстве случаев ОМЛ клетки содержат азурофильную зернистость, единичные палочки Ауэра и имеют типичную для миелобластов цитохимическую характеристику. Реакции на липиды, миелопероксидазу и хлорацетатэстеразу в большинстве клеток положительные с разной степенью интенсивности. ШИК-реакция при этом варианте Од положительная в диффузной форме. Однако следует отметить, что наличие полисахаридов не является строго специфичным ингредиентом. Также положительными в диффузной форме при ОМЛ являются лизосомальные ферменты (кислая фосфатаза, b- глюкуронидаза и кислая неспецифическая эстераза). Таким образом, при ОМЛ могут накапливаться субпопуляции клеток любого уровня дифференцировки. Это могут быть малодифференцированные миелобласты без зернистости в цитоплазме (М₁) и более дифференцированные элементы, представляющие собой гетерогенную популяцию клеток (M₂).

Острый промиелоцитарный лейкоз (ОПЛ) (тип М₃ по классификации FAB). При ОПЛ бластные клетки, количество которых в гемо- и миелограмме составляет 50—60%, характеризуется большим ядром, часто дольчатым и неправильной формы. Размер и очертания ядер варьируют. Бластные клетки содержат обильную зернистость в цитоплазме, иногда с вакуолизацией и палочками Ауэра, нередко в виде "снопов". Некоторые бластные клетки имеют нежную пылевидную зернистость, которая полностью закрывает цитоплазму. Подобная зернистость может наблюдаться также и в более зрелых миелоидных клетках, вклю­чая зрелые гранулоциты. Цитохимически эти клетки очень активны, положительные реакции на миелопероксидазу, липиды, хлорацетатэстеразу, полисахариды выражены в диффузной форме. Активация лизосомальных ферментов в бластных клетках при этом варианте ОЛ положительна в диффузной форме. Характерным для зернистости бластных клеток при ОПЛ является наличие кислых мукополисахаридов. Среди случаев ОПЛ выделяют две группы: типичный гипергранулярный и атипичный микрогранулярный. Морфологические особенности при микрогранулярном варианте могут имитировать особенности бластов при миеломоноцитарном лейкозе. Однако наличие клеток с множественными палочками Ауэра— важный дифференциально-диагностический признак.

Острый миеломонобластный лейкоз (ОММЛ) (M₄ по классификации FAB). Дифференциальная диагностика ОММЛ должна проводиться на основании реакции на анафтилацетатэстеразу с ингибированием фтористым натрием, которая не всегда проводится, чем можно объяснить различия в частоте этих вариантов по данным различных авторов. Бластные клетки у больных ОММЛ характеризуется большим диаметром (15,9 ± 0,5 мкм) по сравнению с клетками при ОМЛ (14,6 ± 0,3 мкм), чаще имеют бобовидную форму ядра (40,2 ± 7,4%) по сравнению с ОМЛ (23,0 ± 1,0%). Количество клеток, содержащих тельца Ауэра, значительно меньше (3,2 ± 0,7%), чем при ОМЛ (18,4 ± 0,5%). Если миелоидные эле­менты преобладают, мазки напоминают М₂, хотя количество моноцитоидных клеток в мазках крови и костного мозга превышает 20%. Если преобладает моноцитоидный компонент, мазки напоминают М₅. Однако могут отсутствовать морфологические признаки монобластов, такие как крупный размер клетки, обильная серо-голубая цитоплазма, лопастное ядро с перекрученным хроматином. В свою очередь миелоидные клетки могут иметь морфологические признаки, затрудняющие их правильную классификацию. Так дольчатость ядер и скудные цитоплазматические гранулы при ОППЛ (тип М по классификации FAB) могут ошибочно трактоваться как моноцитарный лейкоз. Достоверны­ми признаками ОММЛ являются положительная реакция на анафтилацетатэстеразу, ингибирующаяся (в 3,7 раза) фтористым натрием, низкая активность миелопероксидазы и липидов, распределение конечного продукта реакции на гликоген в виде мелких гранул на фоне диффузно-окрашенной цитоплазмы. Для демонстрации наличия двух популяций бластных клеток при ОММЛ используют комплексную реакцию на хлорацетатэстеразу и анафтилацетатэстеразу в одном и том же препарате. Клетки с моноцитоидной направленностью дифференцировки имеют в цитоплазме темно-вишневые гранулы (анафтилацетатэстераза), более мелкие клетки миелоидной дифференцировки содержат в цитоплазме множественные синие гранулы (хлорацетатэстераза).

Острый монобластный лейкоз (тип М₅ по классификации FAB). Сравнительно редкий вариант ОЛ, диагностированный на основании характерных морфоцитохимических признаков. Бластные клетки при ОМонЛ довольно крупные, неправильной формы, часто с перекрученным ядром, с нежной структурой ядерного хроматина и множественными вакуолями в серо-голубой цитоплазме, обычно не содержащей зернистости. Реакция на липиды слабоположительная. ШИК-реакция проявляется в диффузной форме, иногда с пылевидной зернистостью. Характерным марке­ром клеток моноцитоидного ряда является высокая активность неспецифической эстеразы (с а-нафтилацетатом в качестве субстрата), которая полностью подавляется фтористым натрием. Кроме того отмечено повышение активности лизоцима, свойственное моноцитоидному клеточному субстрату. По модифицированной классификации FAB выделяются два подварианта ОМонЛ - М₅. первый — без созревания, при наличии не менее 3% промоноцитов и более 50% бластов и промиелоцитов, второй— с частичным вызреванием, при наличии более 5% промоноцитов-моноцитов и более 50% бластов и промиелоцитов.

Острый эритролейкоз (тип М₄ по классификации FAB) диагностируется, если имеется гиперплазия эритро-монобластов до 40—70% при содержании в костном мозге бластных элементов до 10—30%, что согласуется с данными ряда авторов. Морфологическая характеристика эритроидных клеток может быть без значительных атипизмов, хотя у отдельных больных встречаются резко измененные клетки, с бахромчатыми очертаниями цитоп­лазмы, вакуолизацией, иногда с зернистостью в цитоплазме, гигантскими ядрами, многоядерные с причудливой формой ядра фрагментацией ядра и цитоплазмы. Часто наблюдаются мегалобластоидные изменения. В подобных эритробластах обнару­жен ШИК-положительный материал в виде гранул, в нормобластах — в виде диффузной окраски разной интенсивности. Часть клеток содержит гранулы полисахаридов на диффузном фоне. В эритроидных бластах обнаруживается перинуклеарное распределение кислой фосфатазы и неспецифической эстеразы. В некоторых случаях встречаются кольцевидные сидеробласты. Миелоидные элементы имеют типичную цитохимическую характеристику и иногда содержат палочки Ауэра.

Острый лимфобластный лейкоз (L₁, L₂, L₃ по классификации FAB). Чаще в гематологической практике сталкиваются с L₂ вариантом у взрослых больных ОЛЛ. Властные клетки при этом варианте отличаются выраженным морфологическим полиморфизмом, однако присутствие полисахаридов (ШИК-реакция) и лизосомальных ферментов (кислая фосфатаза, b-глюкуронидаза и кислая неспецифическая эстераза) в гранулярной форме позволяет установить лимфоидную природу этих клеток. У отдельных больных встречались клетки в форме ручного зеркала (эксцентрично расположенное ядро и вырост цитоплазмы на одном из полюсов клетки). В таких клетках отмечалась высокая активность b-глюкуронидазы и кислой фосфатазы в крупногранулярной форме, что указывает на Т-клеточную природу этих клеток. Кроме того, по морфоцитохимическим критериям выделяют два варианта ОЛЛ взрослых: микролимфобластный (с диаметром лимфобластов менее 15 мкм) и микролимфобластный. При микролимфобластном варианте по сравнению с макролимфобластным отмечены: более молодой возраст больных (15—20 лет), меньшее содержание ядрышек в клетке, менее выраженная вакулизация цитоплазмы (чаще встречаются при макролимфобластном ОЛЛ), цитохимическая незрелость, выражающаяся в снижении количества бластных клеток, содержащих полисахариды (37,0 ± 5,6 и 61,0 ± 3,0) соответственно, но большей чувствительностью к химиотерапии: продолжительность жизни в 2 раза больше (25,8 и 12,6 месяцев соответственно).

Ряд авторов выделяют как отдельный вариант острый недифференцированный лейкоз — ОНеЛ, при котором все общепринятые цитохимические реакции в бластных клетках отрицательные. Иногда применение дополнительных гидролитических ферментов (b-глюкуронидаза, кислая фосфатаза, кислая неспецифическая эстераза в гранулярной форме) позволяет отнести ранее диагностированные случаи ОНеЛ к ОЛЛ.

Таким образом, применяемая в клинической гематологии морфоцитохимическая классификация ОЛ, включающая расширенный комплекс цитохимических критериев, позволяет идентифицировать цитологические варианты лейкозов, оценить эффективность лечения и разработать новые подходы к терапии этого тяжелого заболевания.

В основе диагностики гемобластозов как известно лежат традиционные методы — исследование пунктатов костного мозга и периферической крови при лейкозах, гистологических срезов при неходжкинских злокачественных лимфомах (ЗНЛ) и лимфогра­нулематозе (ЛГМ). Использование цитохимических методов позволяет отличить лимфоидные бластные клетки от распознаваемых клеток других ростков кроветворения. Однако, для углубленного изучения отдельных форм и цитологических вариантов опухолевых заболеваний кроветворной и лимфоидной тканей, в настоящее время наиболее перспективным представляется комбинированный подход с учетом клинических критериев и резуль­татов цитоморфологических, цитохимических, а также данных иммунологического анализа маркеров поверхностных мембран клеток. Достижения клеточной иммунологии обусловили новый этап развития исследований по цитохимии лимфоцитов. Основное внимание исследователей уделяется линейно специфическим и дифференцировочным маркерам функционально гетерогенных субпопуляций тимусзависимых и тимуснезависимых лимфоцитов, так называемых Т- и В-лимфоцитов.

Известно, что Т- и В-лимфоциты происходят из общей стволовой клетки, в ядре которой определяется активность терминальной дезоксинуклеотидил-трансферазы (TdT), а на поверхностной мембране обнаруживается О-ОЛЛ-АГ, Ja-подобные антигены (АГ). Предшественники Т-клеток из костного мозга поступают в тимус, проходя последовательные стадии дифференцировки, превращаются в набор субпопуляций иммунорегуляторных Т-лимфоцитов. Другая категория частично коммитированных лимфоидных клеток-предшественников в раннем эмбриональном периоде в печени, а позднее в костном мозге дифференцируется в В-лимфоциты, отвечающие за синтез и секрецию различных классов иммуноглобулинов. В процессе созревания лимфоидных клеток в органах иммунитета и периферической крови изменяется набор их поверхностных антигенов и рецепторов. На основании иммунологического исследования этих маркеров и использования некоторых энзимохимических признаков осуществляется идентификация морфологически сходных субпопуляций Т-и В-лимфоцитов.

В качестве основного средства для изучения онтогенеза Т-лимфоцитов в постнатальном периоде используют набор моноклональных антител (МКА) к тимоцитам человека и к поверхностным дифференцировочным антигенам Т-лимфоцитов серии ОКТ. Кроме того, изучается последовательность экспрессии различных рецепторов (Е, Е₃₇, СЗ, Гс_G, Fc_м, рецепторы к пектинам) на мембранах тимоцитов и их цитохимические особенности. Окончательные индукторные (хеллерные и супрессорные) функции Т4⁺- и Т8⁺- лимфоциты приобретают в периферических органах лимфопоэза. Обнаруживающиеся там лимфоциты утрачивают антиген Т10 и оказываются способными образовывать розетки с эритроцитами барана (ЭБ). Е-розеткообразование, как известно, характерно для незрелых и активированных Т-клеток.

Описанные методы исследования особенно важны в плане диагностики острых лейкозов. Совершенствование в последние годы методов иммунодиагностики ОЛЛ основывается не только на розеточных тестах и определении поверхностных lg, но и на применении панели МКА к антигенам различных кластеров дифференцировки (CD) клеток лимфопоэза. Это позволило выделить 4 иммунологических варианта заболевания среди цитохимически сходных форм ОЛЛ, обусловленных различным происхождением злокачественных клеток. Было доказано, что наиболее часто. встречающимся иммунологическим вариантом является пре-В ОЛЛ, при котором блок дифференцировки бластов соответствовал стадии незрелых В-лимфоцитов. Этому варианту соответствуют следующие комбинации антигенов CD: 10+, 11+, 19+, 20+, 24+„ 38+, в сочетании в 86% случаев с Ja-подобным антигеном. Для бластных клеток пре-Т варианта свойственно наличие фенотипа ранних предшественников Т-лимфоцитов (CD5, CD38). Причем, как и в предыдущей группе у части больных отмечены признаки атипичной аномалии (отсутствие Ja- и CD38- подобного антигена). Кроме того, группа Т-ОЛЛ также не является однородной по экспрессии антигенов и разделяется на два подварианта: тимический и зрелый Т-ОЛЛ (активированный). Властные клетки больных тимическим и зрелым Т-ОЛЛ имеют характер­ную антигенную структуру, однако и в этих случаях выявлена утрата одного из определяющих антигенов: CDJa- при типическом варианте и CD2- при зрелом Т-ОЛЛ. Для В-варианта (встре­чающегося крайне редко), как известно, характерно наличие mJg я Ja-подобного антитела. Кроме того, известен гибридный вариант ОЛЛ, для которого характерна экспрессия на лейкозных клетках одновременно лимфоидных и миелоидных антигенов.

Сравнительный анализ иммунологического фенотипа с цитохимическими показателями лейкозных клеток больных ОЛЛ показал, что активность лизосомальных ферментов (кислая фосфатаза, b-глюкуронидаза, кислая неспецифическая эстераза) и гликогена определялась в гранулярной форме независимо от варианта заболевания. Однако, степень их цитохимической активности различна в зависимости от маркерного фенотипа лимфобластов. То есть, при более зрелых вариантах Т-ОЛЛ (активированный) активность гидролитических ферментов достоверно выше. Сведения о цитохимических признаках клеток при В-ОЛЛ немногочисленны. Сообщается об отрицательных реакциях бластных клеток при выявлении активности кислой фосфатазы, кислой неспецифической эстеразы, ДАШУ, слабая диффузная окраска при постановке PAS- реакции.

Характерным для ОМЛ является сочетание следующих антигенов CD: 11а+, 13+, 15+, 36+, 65+, HLA-DR. Фенотипбластных клеток больных ОММЛ характеризуется экспрессией антигенов CD: 11à+, 13+, 14+, 15+, 38+, HLA-DR. Для лейкозных клеток больных ОМнЛ наиболее частым является сочетание антигенов CD: 11à+, 13+, 38+, HLA-DR. Отличительным призна ком ОММЛ и ОМнЛ (типов М^ и М^ по FAB) является экспрессия антигена CD14, отсутствующего на лейкозных клетках больных ОМЛ (тип М^ и Mg по FAB). Однако, в практическом плане на данном этапе развития исследований следует считать, что решающее значение для выделения основных форм острых лейкозов имеют результаты цитохимических реакций. Для разделения цитологических вариантов миелоидной природы достаточно провести детальный анализ морфоцитохимических признаков. Данные иммунологического изучения поверхностного фенотипа позволяют более тонко отдифференцировать варианты и подварианты лимфоидных форм острого лейкоза. Кроме того, актуальной задачей современной гематологии является также замена иммунофлюоресцентных методов светооптическими и иммуноэнзимохимическими методами, что позволяет широко внедрить способы иммунофенотипирования в клиническую практику. Такими методами в настоящее время этапе являются иммуноцитохимические методы (АПААП.ПАП и др.), с помощью которых можно одновременно изучать антигенный профиль и морфологию клеток. При подобном подходе все меньше остается неклассифицированных форм острых лейкозов, что позволяет проводить более раннюю диагностику вариантов ОЛ. Кроме того, выявленная корреляция иммунологических вариантов с некоторыми цитохимическими показателями подтверждает целесообразность разработки более углубленной классификации ОЛЛ, что может оказаться полезным не только для диагностики, но и для совершенствования протоколов лечения данных больных.