-
Варианты анализа
П Иммунный анализ основан на измерении доли занятых активных центров.
Любой иммунный анализ базируется на измерениях доли занятых активных центров. Другими словами, принцип анализа основан на определении доли занятых центров, или косвенно — доли незанятых центров. Как будет показано в этом разделе, рассмотрение доли занятых активных центров антител приводит к заключению, что, если измеряют оставшиеся незанятыми центры, максимальной чувствительности достигают, когда концентрация антитела стремится к нулю; варианты, удовлетворяющие этому условию, обычно называют «конкурентными». Напротив, методы, в которых напрямую измеряют занятые центры, требуют высоких уровней антител и называются «неконкурентными». Следует, однако, сознавать, что эти термины несколько субъективны, поэтому возникает парадокс, особенно для «неконкурентного» варианта, когда анализ может быть отнесен к любой из двух категорий в зависимости от выбранного этапа. Поэтому важно помнить, что эти довольно двусмысленные термины используют применительно к этапу первичного распознавания. Из-за различных условий оптимизации конкурентный и неконкурентный иммунный анализы могут значительно отличаться в выполнении для данного диапазона концентраций: эти различия следует рассматривать при выборе оптимального варианта для конкретного приложения.
-
Конкурентный анализ
Конкурентный иммунный анализ включает конкуренцию между определяемым веществом пробы и меченым определяемым веществом за ограниченное число активных центров.
В конкурентном иммунном анализе устанавливают число центров, не занятых пробой; он может иметь различные варианты, но суть в том, что определяемое вещество пробы смешивают с меченым определяемым веществом, и они конкурируют за активные центры (рис. 7.9-4). Метод требует разделения связанного и свободного антигена или антитела с целью определения их относительных количеств. Если определяют антиген, присутствие меченого антигена позволяет оценить относительное разделение. Как можно заключить из кривых на рис. 7.9-3, оптимальная чувствительность достигается при уменьшении концентраций меченого антигена и антитела.
Рассмотрим сигналы компонентов в конкурентном анализе: сначала обсудим условия, когда проба отсутствует и сигнал, относящийся к связанным антителу-антигену в присутствии только меченого антигена, определяется уравнением
(7.9-7)
Рис. 7.9-4. Конкурентный анализ для тест-определения антител.
где 50бщ — сигнал, который был бы получен при прямом измерении [А§0бщ]-Сигнал неспецифического связывания 5НС — функция доли неспецифического связывания оставшегося свободного антигена.
(7.9-8)
где В„с— доля неспецифически связанного антигена. Таким образом, при уменьшении концентраций меченого антигена и антитела с той целью, чтобы сместить динамический диапазон определений в область меньших концентраций, ошибки из-за неспецифического связывания начинают оказывать все большее влияние на точность определения. Каждое сочетание специфического и неспецифического связывания будет иметь свое оптимальное сочетание концентраций антитела и меченого антигена. Полное устранение неспецифического связывания или разделение связанной и свободной фаз невозможно со 100%-ной эффективностью, так что концентрацию антитела, вообще говоря, следует увеличивать, чтобы увеличить вклад специфического связывания. В присутствии только меченого антигена 5о определяют по уравнению деляется степенью связывания. Однако в присутствии пробы (немеченого антигена) :
(7.9-9)
(7.9-10)
(7.9-11)
где
—
антиген пробы, а
—
меченый антиген.
Для данной концентрации меченого антигена сигнал связанного антигена Ag* уменьшается при небольшой добавке антигена пробы (немеченого) [AAg*].
Из кривых на рис. 7.9-5 очевидно, что изменение сигнала в результате [ДА§*] является функцией концентрации антитела, используемой в анализе (рис. 7.9-5,6), и что уровень антител, дающий максимальную чувствительность, зависит от концентраций меченого и определяемого антигена. Традиционно системы иммунного анализа имеют тенденцию давать погрешность при высокой концентрации реагента со степенями связывания 0,4-0,5. Действительно, из рис. 7.9-3,а и б, видно, что связывание в этой области (0,4-0,5) слишком велико, чтобы привести к большому изменению степени связывания антигена при низкой концентрации последнего. Однако нельзя игнорировать сигнал, относящийся к неспецифическому связыванию, поэтому чувствительностью поступаются в пользу более низких помех за счет неспецифического связывания при более высоких концентрациях антител.
Хотя конкурентный вариант иммунного анализа имеет свои преимущества и очень популярен, он имеет и практические ограничения. Очевидным недостатком является то, что маркирование определяемого вещества Ag* может изменить или даже полностью устранить способность связываться с АЬ; вторая опасность особенно существенна, если маркирование включает в связывание критический эпитоп. Если кинетика связывания меченого и немеченого антигена различается, это следует учитывать в расчетах. Иногда, особенно при использовании меченых гаптенов, метка может улучшить распознавание. Это видно, когда меченый конъюгат использует то же положение на гаптене, что и ранее используемое в белковом носителе, требуемом для получения антител.
Рис. 7.9-5. а — кривая разбавления антитела для меченого антигена Ag* и влияние добавления небольшого количества немеченого антигена Ag*; б — изменение связывания ДЬ вследствие добавки AAg* при Различных игхояных гтрттрнях гнязыва.ния.