5. Потенциометрические сенсоры

D Потенциометрические измерения связаны с уравнением Нернста.

Не все вещества можно определить с помощью окислительно-восстановительной системы; следует испробовать другие параметры, а не только перенос электрона. Действительно, даже если для интересующего нас определя-

Рис. 7.8-13. Схематическое изображение цепи электронного транспорта фотосинтеза (ЭТФ). На входе —Н₂О и свет, на выходе-NADP и О₂. Белки ЭТ< представлены с помощью сокращенных названий или в виде темных кружков.

Рис. 7.8-14. Диаминодурол (С-замещенный n-фенилендиамин) в качестве медиатора фототока в клетках Synechococcus. a — ток электрода как отклик на импульс света. Транспорт заряда и PSII активируется и прерывается медиатором на Q-белке (рис. 7.8-13); б — детектирование двух активных в ЭТФ гербицидов. График пикового фототока построен в зависимости от времени (ppb — миллиардные доли).

емого вещества имеется редокс-фермент, он может не всегда подходить для применения амперометрического метода. Альтернативой являются потенцио-метрические измерения.

Интерпретация сигнала

Измеряемый потенциал (Е) определяется уравнением Нернста (разд. 7.3), и для изменения активности иона i это уравнение имеет вид:

(7.8-13)

так что измеряемый параметр логарифмически связан с концентрацией определяемого вещества. Как мы уже видели (разд. 7.3), хитрость с потенциомет-рическим измерением заключается в том, чтобы заставить его отвечать селективно только на один ион; соответственно в биосенсоре изменение ионного транспорта должно происходить в результате биораспознавания. [Н⁺] — главная переменная, хотя величина рН может изменяться непосредственно или через равновесие с СОз или NHs- В последнем случае можно использовать мембрану, содержащую ионофор на аммоний, или рН-чувствительную поверхность.

В случае изменения рН, связанного с ферментом, конечный отклик рН-сенсора зависит от баланса всех равновесий, включающих Н⁺: реакций прото-нирования и депротонирования продуктов ферментативной реакции, буферной емкости и т. п. Если рассматривать только прямой «выход» ферментативной реакции, без равновесий, связанных с буферной емкостью и т. д., и предпола-

гать, что [Н⁺] непосредственно связан с расходом субстрата (S), то измеряемый потенциал будет связан с [S]. Как видно из предыдущего обсуждения, касающегося амперометрической стационарной модели, ход взаимодействия предсказывают, оценивая как диффузия в слое иммобилизованного фермента влияет на ферментативную кинетику. Здесь нет медиатора и конкуренции с молекулярным кислородом, вместо этого имеется прямое определение продукта ферментативной реакции. Используя подход, подобный описанному выше, и начиная с уравнения

(7.8-14)

где у — расстояние поперек мембраны, получаем тот же модуль Тиле, дающий информацию об источнике изменения величины сигнала

(7.8-15)

Применение подходящих граничных условий приводит к значениям концентрации субстрата и/или продукта поперек ферментного слоя. Решение показывает, что когда km 3> [8ь], поверхностная концентрация на лежащей ниже потенциометрической мембране связана с [Зь]. Однако, когда km «С [Зь], отклик будет зависеть от относительных скоростей ферментативной реакции и диффузионного массопереноса и не будет зависеть от [Зь].

Как упомянуто выше, баланс между ферментативным и буферным равновесиями вносит вклад в измеряемый сигнал. Теоретическая кинетическая модель, учитывающая все эти связанные явления, предсказывает стационарный отклик ферментного рН-сенсора [7.8-41]; существование «нернстовского» наклона не предсказано и не имеет такого значения, как для ион-селективных электродов, выполняющих прямое измерение ионного транспорта.

Была сделана попытка объяснить эффект, связанный с белком на границе раздела [7.8-42], и показать, как можно использовать оксидную поверхность полевого транзистора (ПТ) для наблюдения за динамическим откликом белков. На амфотерной поверхности неорганического оксида гидроксильные группы находятся в равновесии (схема 7.8-12), и, таким образом, на поверхностный потенциал Ф будет влиять значение рН в объеме ([Н^]) в зависимости от буферной емкости поверхности. Поверхности, имеющие большие количества групп OHJ и 0~, поддерживают значение [Н+] (Н⁺ в «растворе» вблизи от поверхности) постоянным в широком интервале рН, при этом Ф должен иметь нернстовский отклик на [Н^].

Когда белок также находится на поверхности, равновесие принимает более сложный вид. Белок состоит из большого числа пептидов, содержащих ионизирующиеся группы, каждая из которых имеет свое собственное равновесное значение рН (схема 7.8-13). Отношение активностей внутренних (i_in) и внешних (i_ex) подвижных ионов в этой «системе» дает вклад в потенциал Доннана:

Схема 7.8-13. Пептидные равновесия.

Схема 7.8-12. Амфотерное равновесие на поверхности неорганического

оксида.

При рН, смещенном от изоэлектрической точки pi, этот потенциал соответствует разности между «внутренним рН» белка и раствором. Любые изменения aj_ex будут вызывать изменение 4т> и заставлять белок высвобождать или принимать протон, чтобы восстановить равновесие. Во время этого восстановления непосредственное окружение белка будет испытывать временное изменение рН из-за притока/оттока протонов. Если белок иммобилизован вблизи от ион-селективного полевого транзистора (ИСПТ), это влияние концентрации ионов можно измерить, потому что ИСПТ очень быстро реагирует на изменения поверхностного заряда.

Ферментативный анализ

Потенциометрические измерительные устройства наиболее часто разрабатывают на основе рН-чувствительных электродов, и в рН-ПТ используют те же аналитические реагенты, что и в ИСЭ. Можно применять любую ферментативную реакцию, которая приводит к изменению Н⁺ (например, схемы 7.8-2 и 7.8-14).

Использование биораспознающих молекул для анализа обеспечивает специфичность отклика биосенсоров. Однако специфичность зависит от природы биораспознающей системы. Менее специфичная распознающая система может быть невыгодной, но в некоторых случаях, когда при этом проявляется специфичность к другим субстратам, она может оказаться полезной. Например, каталитическое расщепление связи углерод-фтор с помощью пероксидазы хрена в присутствии сенсора на фторид-ион [7.8-43] дает полезный способ детектирования фторорганических соединений.

D Потенциометрический сигнал часто можно получить косвенным путем, вызывая изменения поверхностного заряда или селективного транспорта частиц.

В разд. 7.3 показаны другие системы потенциометрического измерения, которые могут быть пригодными для сочетания с ферментативными реакциями. Рассмотрите различные классы ферментов и определите, какие из них пригодны для потенциометрического анализа.

Иммунный анализ

Другим приложением потенциометрических сенсоров и устройств ПТ является иммунный анализ, включающий образование комплекса антитело-антиген [7.8-44]. Теоретические основы этих измерений не всегда ясны. Например, Аизава [7.8-45] приготовил и установил в потенциометрической ячейке специфичную к антителам Вассермана мембрану на основе липидного антигена из кардиоли-пина, фосфатидилхолина и холестерина в триацетилцеллюлозе. Предполагают, что отклик возникает за счет изменения ионообменных свойств мембраны при связывании антитела. Шасфурт и др. [7.8-46] сообщали о способе применения серии ступенчатых изменений концентрации электролита и контроля мембранного потенциала с использованием Нечувствительного ПТ с быстрым откликом (см. разд. 7.8-3) как методе иммунного анализа. Этот метод подходит для измерения любого процесса на поверхности, который включает изменение поверхностного заряда.