-
Эффективность связывания антител
Для данного антитела на связывание антигена влияет наличие активного центра и его конформационная целостность. Связывание большее, чем ожидаемое, может также являться результатом неспецифического взаимодействия с определяемым веществом. В случае систем твердофазного анализа использование поверхностно-активных веществ, чтобы сделать поверхность менее гидрофобной, может уменьшить вторую проблему, но высокая концентрация поверхностно-активного вещества может привести также к потере антител, если они связаны нековалентно.
Как во всех методах анализа, всегда существует полезный рабочий диапазон, в пределах которого анализ имеет значимость. Для сандвичевых определений очень высокие концентрации определяемого вещества приводят к насы-
щению как захватывающего, так и контрольного антитела, так что кажущаяся измеренная концентрация «сандвича» захватывающее антитело/определяемое вещество/контрольное антитело оказывается ниже, чем ожидаемая (рис. 7.9-21). Это явление называют эффектом высокой дозы.
В конкурентном анализе наблюдается эффект низкой дозы, когда связывание меченого антигена при низкой концентрации антигена в пробе больше, чем в отсутствие определяемого вещества, из-за положительной кооперации.
Менее предсказуемыми оказываются ошибки за счет эндогенных антител, способных связывать один из аналитических реагентов. Эта проблема подобна тем, которые встречаются при эндогенном связывании антигена, обсуждаемом выше, но здесь возможные меры менее очевидны. Сандвичевый анализ в наибольшей степени подвержен мешающему влиянию гетерофильных антител IgG и IgM в пробе, способных присоединяться к захватывающему антителу и предоставлять активный центр контрольному антителу. Существование такой проблемы неудивительно, так как антитела к животному IgG в пробе могут перекрестно реагировать с реагентными антителами, но введение сыворотки или иммуноглобулинов из тех же частиц, что и реагенты, обычно эффективно предотвращает мешающее влияние этого типа. Альтернативным подходом является использование только Fab-фрагмента, содержащего специфический активный центр в качестве контрольного антитела взамен целой молекулы IgG, что помогает избежать образования ложного сигнала.
Ошибки образования сигнала
Рис. 7.9-21. Эффект высокой дозы (кривая в форме «крюка»).
Основным источником ошибок при образовании сигнала является какое-либо ингибирование метки. Например, флуорофор может тушиться эндогенными частицами пробы или на ферментную метку может влиять присутствие ингибиторов либо усилителей. Как было показано ранее при обсуждении, эти
эффекты можно использовать в качестве важных свойств анализа, но там, где это не так, они могут вносить ошибки.
К сожалению, как и для многих мешающих веществ, не всегда бывает просто предсказать или устранить проблему, так что тщательное опробывание метода анализа в той окружающей среде, в которой он будет использован, весьма существенно для полноты метода.
Литература
Bangs, L.B., Uniform latex particles. Seradyn Diagnostics Inc. Particle Technology
Division 1987.
Diamandis, E.P., Clin. Biochem., 1988, 21, 139. Hunter, W.M., Corrie, J.E.T., Immunoassay for Clinical Chemistry. Churchill
Livinghstone, Edinburgh 1983. Langone, J.J., van Vunakis, H., Irnmunochemical Techniques, Part A. Methods in
Enzymology., Vol. 70, Academic Press, New York 1988. Langone, J.J., van Vunakis, H., Irnmunochemical Techniques, Part B. Methods in
Enzymology., Vol. 73, Academic Press, New York 1988. Langone, J.J., van Vunakis, H., Irnmunochemical Techniques, Part C. Methods in
Enzymology. Vol. 74, Academic Press, New York 1988. Langone, J.J., van Vunakis, H., Irnmunochemical Techniques, Part D. Methods in
Enzymology. Vol. 84, Academic Press, New York 1988. Miles, L.E.M., Hales, C.N., Nature, 1968, 219, 186-189. Price, C.P., Newman, D.J. (Eds.) Principles and Practice of Immunoassay. New York,
Stockton Press 1991.
Robinson, P.J., Dunhill, P., Lilly, M.D., Biotech. Bioeng., 1973, 15, 603-6. Rubenstein, K.E., Schneider, R.S., Ullman, E.F., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1972,
47, 846-851. Thorell, J.L., Larson, S.M., Radioimmunoassay and related tecnhiques., Mosby, St Louis
1978.