Контрольні запитання

• Поняття нейтралізму, конкуренції, синтрофії, симбіозу, коменсалізму, мутуалізму, антагонізму, паразитизму, хижацтва.

• Конкуренція як одна із форм співіснування бактерій. Генералісти і спеціалісти.

• Синтрофні взаємовідносини серед мікроорганізмів.

• Антагоністичні взаємовідносини серед бактерій.

• Характерні ознаки актиноміцетів.

• Методи визначення антагоністичних властивостей актиноміцетів.

• Методи визначення антимікробного спектра чистих культур мікроорганізмів.

Розділ ііі. Роль мікроорганізмів у біологічному кругообігу речовин

Мікроорганізми беруть участь у складних ґрунтових процесах. Їх специфічність визначають наявністю й життєдіяльністю фізіологічних груп бактерій. До кожної фізіологічної групи, як правило, входять абсолютно різні у систематичному відношенні мікроорганізми, але їх об’єднує спільність здійснюваних ними перетворень. У процесі ґрунтоутворення й підтримки родючості ґрунтів важливу роль відіграють мікроорганізми, які беруть участь у кругообігу азоту й вуглецю.

Тема 4. Амоніфікуючі бактерії

Амоніфікацією називають процеси розщеплення органічних азотовмісних речовин (білків, карбаміду, хітину) з утворенням аміаку як кінцевого продукту. Здатність до амоніфікації притаманна значній кількості видів мікроорганізмів. Усі амоніфікатори виділяють до середовища протеолітичні ферменти, під дією яких відбувається гідроліз білків до амінокислот. Останні використовуються мікроорганізмами в енергетичних і конструктивних процесах. Кінцевими продуктами розщеплення білків є NH₃ i H₂S. Розщеплення органічних азотовмісних сполук можуть здійснювати аеробні форми родів Pseudomonas та Bacillus, факультативні анаероби роду Proteus та облігатні анаероби роду Clostridium. Процес анаеробного розщеплення білків називають гниттям.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА

Мета роботи: виділити з ґрунту амоніфікуючі бактерії і визначити їх різновиди.

Завдання

1. Отримати накопичувальну культуру амоніфікаторів з різноманітних типів ґрунтів.

2. Виділити споротвірні форми амоніфікуючих бактерій.

3. Отримати збагачену культуру уробактерій.

Матеріали та обладнання

1. Мікроскоп МБІ-1, предметні скельця, імерсійна олія, бактеріологічна петля, скальпель, шпатель.

2. Стерильні пробірки та піпетки на 10, 5 і 1 мл, стерильні чашки Петрі, колби на 200-500мл, чашки і пробірки з МПА, зразки ґрунту.

3. Смужки фільтрувального паперу, обробленого розчином оцтовокислого свинцю; лакмусовий папірець.

4. Генціановий фіолетовий, фуксин, розчин Люголю, 96%-й етиловий спирт, м’ясопептонний агар, м’ясопептонний бульйон, оцтовокислий свинець.

Хід роботи

Одержання накопичувальної культури амоніфікаторів

Для виділення і культивування амоніфікаторів здебільшого використовують різноманітні поживні середовища, які містять білкові речовини. Найбільш використовуваним середовищем є МПБ. Посів проводять таким чином: ґрунт на кінчику стерильного скальпеля вносять у пробірку з МПБ, після засівання під корок пробірки поміщають рожевий лакмусовий папірець і смужку фільтрувального паперу, обробленого насиченим розчином оцтовокислого свинцю. Посіви витримують за 25°С. Про розвиток амоніфікуючих бактерій у МПБ свідчить помутніння води, утворення в ній пластинок чи осаду, поява плівки на поверхні середовища, виділення аміаку й сірководню. Про виділення NH₃ свідчить посиніння лакмусового папірця; про створення H₂S – почорніння паперу, обробленого оцтовокислим свинцем. З усіх проб готують мазки, їх фарбують за Грамом і розглядають під мікроскопом, мікроскопічну картину замальовують. Показники розвитку амоніфікуючих бактерій у МПБ заносять до табл. 4.

Виділення споротвірних форм амоніфікуючих бактерій

Представники роду Bacillus відіграють значну роль у мінералізації органічних речовин у ґрунті. До цього ряду належать паличкоподібні бактерії різної довжини, грампозитивні, рухливі, частіше перетрихи, різноманітні за своїми фізіологічними властивостями. Спора може бути розміщена центрально, термінально (на кінці клітини) чи субтермінально. Спори мають багатошарову оболонку, містять у собі мало вільної води, добре переносять несприятливі умови, згубні для вегетативних клітин. Виявляють споротвірні амоніфікатори таким чином: 5 г ґрунту вміщують у колбочку з 45 мл стерильної води, розмішують протягом 5 хв і нагрівають на водяній бані за 80°С 10 хв. Під час пастеризації вміст колби декілька разів перемішують. Прогріваючись, вегетативні клітини бактерій гинуть, тоді як спори зберігають життєздатність. Після охолодження ґрунтового розчину з нього роблять висів на середовище Мішустіна (МПА +сусло агар у співвідношенні 1:1). На поверхню поживного середовища стерильним шпателем рівномірно розподіляють краплю засівного матеріалу. Потім цим же шпателем роблять посів в наступну чашку. Зробити посів можна петлею виснажливим штрихом. Посіви витримують у термостаті за температури 28°С 48 год.

Характер колоній вивчають за допомогою бінокулярної лупи чи мікроскопа з малим збільшенням. Колонії описують, їх розглядають під мікроскопом і мікроскопічну картину замальовують. До найпоширеніших ґрунтових споротвірних амоніфікаторів відносяться такі бактерії.

– В.cereus. Колонії плоскі, мають рівну матову поверхню і хвилясті чи ризоїдні краї. Клітини товсті, розташовуються одиночно чи ланцюжком. Спори розміщені центрально.

– В.cereus var. mycoides. Колонії плоскі ризоїдальні чи міцелеподібні, які стеляться по поверхні агару. Пучки ниток відходять від краю колонії, утворюючи псевдорозгалуження. Нитки можуть бути закрученими вправо чи вліво, тому відрізняють право- чи лівозакручені форми. Клітини здебільшого з'єднані в нитки. Спори розміщені центрально.

– В.megaterium. Колонії гладенькі, білі, випуклі, жирноблискучі, рідко–складчасті. Краї колонії різко обрізані чи хвилястобахромчаті. У молодої культури клітини товсті, у старої – більш короткі, округлені й навіть колоподібні. Спори овальні, розміщені центрально.

– В.mesenteriсus. Колонії тонкі, сухі, зморшкуваті, не зростаються з субстратом, безбарвні, рудуваті чи жовтувато-руді, мають багато різновидів.

– В.subtilis. Колонії дрібнозморшкуваті, сухі чи зернисті, зростаються із субстратом. Палички порожні й тонкі. Спори овальні, розміщені центрально.

Таблиця 4

Розвиток амоніфікаторів у МПБ

Зразок ґрунту	Помутніння середовища	Пластинки	Осад	Виділення		Опис мікроскопічного препарату
				NH3	H2S

Примітка. Як контроль використовують стерильне, не засіяне ґрунтом, середовище.

Виділення уробактерій

Уробактерії синтезують фермент уреазу і амоніфікують сечовину. Бактерії здатні витримати високу лужність середовища. На цій властивості ґрунтується створення елективних умов для їх культивування. Для отримання накопичувальної культури уробактерії здійснюють посів грудочки ґрунту в синтетичне поживне середовище такого складу (г/л): сечовина – 5,0, двозаміщений фосфат калію – 0,5, сульфат магнію – 0,2, яблучнокислий або виннокислий калій чи натрій – 5,0, дистильована вода (стерилізують за 0,5 атм 30 хв). Посіви витримують за 28⁰С. Накопичення аміаку встановлюють за допомогою лакмусового папірця. 3 посівів готують препарати, їх фіксують, зафарбовують за Грамом, розглядають під мікроскопом, мікроскопічну картину замальовують.