10. Оставьте чашки при комнатной температуре, пока 14

не затвердеет верхний агар или не впитается жидкость.

10. Переверните чашки и инкубируйте .их при 37 °С. Колонии должны появиться через 12—16 ч.

Если в данной работе используется плазмидная ДНК, то есть осуществляется простая перетрансформация готовой чистой плазмидой, выход трансформантов должен быть высоким и обычно составляет сотни колоний на чашку. При клонировании и, особенно, трансформации конструкциями, содержащими специфические вставки, выход трансформантов может быть гораздо ниже – десятки и единицы колоний. Основные принципы получения искусственных рекомбинантных ДНК рассмотрены в следующих разделах.

Работа 3.

Рестрикция векторной и клонируемой днк

Для специфического разрезания векторных молекул и получения фрагментов ДНК для вставок, в качестве инструмента используются природные ферменты – рестриктазы. Они служат своеобразными молекулярными «ножницами». Без них невозможно представить себе современную генетическую инженерию. Они используются при клонировании, создании сложных искусственных генетических конструкций, молекулярно-генетическом анализе, картировании хромосом, направленном мутагенезе и других исследованиях.

Рестриктазы, или рестриктирующие эндонуклеазы, — это ферменты, «узнающие» определенные последовательности (сайты рестрикции) в двухцепочечной ДНК и расщепляющие эти молекулы ДНК. Их выделяют преимущественно из прокариотических клеток. В природе рестриктазы являются орудием защиты клеток от чужеродной ДНК. Процесс рестрикции сопряжен с процессом метилирования собственной ДНК по тем же

15

сайтам, которые узнает рестриктаза в составе чужой ДНК. Метилированная ДНК защищена от разрезания.

Существуют три типа ферментов рестрикции-модификации. Ферменты типа I и типа III обладают модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой рестриктирующей активностью, проявляемой одним и тем же белком. Ферменты обоих типов «узнают» неметилированные последовательности в ДНК, но ферменты типа I вносят случайные разрывы, в то время как ферменты типа III разрезают ДНК в специфических участках.

Системы рестрикции-модификации типа II включают два отдельных белка: рестриктирующую эндонуклеазу и модифицирующую метилазу. Именно ферменты этой группы преимущественно используются в молекулярном клонировании.

Рестриктазы разрезают ДНК внутри или около своих сайтов, которые обычно представляют собой последовательность двухцепочечной ДНК длиной 4—8 нуклеотидов, обладающую осью симметрии второго порядка. Например, фермент EcoRl вносит разрыв не точно по оси второго порядка, а в точках, отстоящих друг от друга на четыре нуклеотида:

5^’------G↓A A T T C-----3^’

3^’ - ----C T T A A↑G-----5^’

↓ ↑

5^’-----G 5^’-A A T T C-----3^’

3^’- ----C T T A A-5^’ G-----5^’

В результате разрыва образуются фрагменты с выступающими липкими 5'-концами. Каждый такой конец может взаимодействовать с любым другим концом, комплементарным ему. Таким образом, любые молекулы ДНК, содержащие

16

одинаковые липкие концы, можно соединять друг с другом и в результате получать рекомбинантные молекулы. Повышение температуры и снижение ионной силы способствует диссоциации липких концов и разделению фрагментов, а понижение температуры и повышение ионной силы способствует связыванию фрагментов за счет усиления комплементарных взаимодействий основыний липких концов.

Многие ферменты рестрикции катализируют разрывы, в результате которых образуются фрагменты ДНК с выступающими 5'-концами, под действием других образуются фрагменты ДНК с выступающими З'-концами, третьи разрезают ДНК с образованием фрагментов с тупыми концами.

Для каждого фермента рестрикции существуют оптимальные условия реакции, которые приводятся в описании, прилагаемом фирмой-изготовителем. Основные параметры — это температура инкубации и состав буфера. К температурному режиму предъявляются достаточно жесткие требования, тогда как различия между буферами чаще всего менее значительны. По требованию к составу буфера рестриктазы делятся на три группы: ферменты, лучше всего функционирующие при высокой ионной силе, ферменты, для которых желательны средние ее значения, и ферменты, работающие в буферах с низкой ионной силой.

Буферы, используемые при расщеплении рестриктирующими эндонуклеазами

Ионная сила буфера	NaCl, мМ	Tris-HCl, рН7,5	MgCl, мМ	Дитио-треитол, мМ
Низкая	0	10	10	1
Средняя	50	10	10	1
Высокая	100	50	10	1

Примечание: Для некоторых рестриктаз требуются специальные буферы.

17

Практически всегда стандартные рестриктазы поставляются в комплекте с оптимальным буфером десятикратной концентрации, который просто добавляют при составлении реакционной смеси. Единица ферментативной активности рестриктаз определяется как количество фермента, полностью расщепляющее в оптимальных условиях 1 микрограмм стандартной ДНК (например, ДНК плазмиды или фага ) за единицу времени, обычно за час. Поэтому в реакционную смесь добавляется обычно от одной до нескольких единиц рестриктазы на один микрограмм расщепляемой ДНК. Для полного расщепления некоторых трудно расщепляемых матриц лучше не увеличивать сильно концентрацию рестриктазы, а увеличить время расщепления. Другим критическим параметром является концентрации ДНК. Даже при использовании высокой концентрации очень чистой ДНК, например после равновесного центрифугирования в радиенте хлористого цезия, при рестрикции некоторые рестриктазы начинают расщеплять ДНК неспецифично, говорят, что в таких условиях у них проявляется стар-активность (от star – звездная). При использовании не очень чистой ДНК, например плазмидной, выделенной по стандартной методике, повышение её концентрации приводит к недорестрикции и даже полному подавлению расщепления из-за наличия ингибирующих примесей. Простое разбавление реакционной смеси соответствующим буфером может исправить ситуацию. Поэтому стараются, чтобы концентрация ДНК при рестрикции не превышала 5-10 мкг/мл. Если нужно получить много расщепленной ДНК в препаративных целях – увеличивают объем реакционной смеси. Для анализа рекомбинантной ДНК, выделенной из колоний после трансформации клеток, рестрикцию проводят обычно в объеме 10-20 мкл, например по следующей схеме:

18

Состав рестрикционной смеси
Компоненты	Объем
1. Раствора плазмидной ДНК (0,1-1,0 мкг/мл)	5 мкл
2. 10х рестрикционый буфер	2 мкл
3. Рестриктаза (10- 20 тыс. единиц / мл)	0.1 - 1мкл
4. Вода	12 мкл
Всего	20 мкл

Примечание: Если используемые препараты ДНК содержат примесь РНК, добавляют 1 мкл РНКазы (1 мг/мл), поскольку РНК может мешать обнаружению рестрикционных фрагментов при электрофорезе

Реакцию проводят в течение часа при 37⁰С (или другой оптимальной для рестриктазы температуре). После окончания реакции многие рестриктазы можно инактивировать нагреванием до 65⁰С. В этом случае переосаждение обычно не требуется. Для термостойких рестриктаз приходится проводить экстракцию фермента фенол-хлороформенной смесью и/или переосаждение ДНК.