Задание для самостоятельной работы:

1. Изобразите схему клонирования с использованием дефосфорилированной плазмиды. Какие продукты образуются после лигазной реакции? Почему они могут вызывать трансформацию, в отличие от дефосфорилированной плазмиды?

2. Нарисуйте схему клонирования с использованием сразу двух рестриктаз. Какие возможны побочные продукты лигазной реакции? Какие из них могут участвовать в трансформации?

Работа 4.

Получение бактериальных клонов, трансформированных рекомбинантной днк

25

Ход работы

1. Получение фрагментов клонируемой ДНК и векторной плазмиды с липкими концами с помощью рестрикции, как описано в предыдущей работе или после их очистки электрофорезом в агарозном геле (описано ниже).

2. Составление лигазной смеси в расчете на конечный объем 20 мкл следующего состава:

10х лигазный буфер 2 мкл

10мМ АТФ (рибо-АТФ) 2мкл

ДНК-лигаза 1 мкл

Смесь рестрицированных

фрагментов и вектора в объеме до 15 мкл

вода до общего объема 20 мкл, если необходимо

3. Проведение лигазной реакции: после перемешивания пробирку помещают в термостат (холодильник) с температурой 14-16⁰ на ночь

4. Трансформация компетентных клеток лигазной смесью, как описано в предыдущих работах

5. Селекция и анализ рекомбинантных клонов, описанная в следующем разделе

При проведении работы необходимо учесть следующие методические замечания:

а) Лигазная реакция требует присутствия АТФ в качестве источника энергии. Она не встраивается в ДНК, а гидролизуется в ходе реакции до АДФ и фосфата. Используется обычная АТФ (рибо-АТФ), а не dАТФ (дезоксирибо-АТФ), как при синтезе ДНК

б) Для получения достаточно хорошего выхода кольцевой рекомбинантной ДНК со вставкой необходимо, чтобы более короткий клонируемый фрагмент присутствовал в лигазной смеси не менее, чем в 3-5 кратном избытке по молярному

26

соотношению (пересчет на массу осушествляется по длине фрагмента)

в) Абсолютная концентрация векторной плазмиды должна быть низкой. При этом происходит преимущественно замыкание в кольцо, а при высоких концентрациях – в основном образуются длинные линейные полимерные формы.

Скрининг и анализ рекомбинантных клонов

Во всех случаях при клонировании существует вероятность получения клонов, содержащих разные плазмиды, включая исходную, из-за недорестрикции или восстановления плазмиды после лигирования, и различные варианты рекомбинантных плазмид, даже если клонируется индивидуальная последовательность ДНК. Тем более сложная картина получается, если клонируют смесь геномных фрагментов, например, при создании банков генов. Поэтому, с одной стороны, требуется как-то отличить нетрансформированные бактерии, не содержащие плазмиду, бактерии, содержащие исходную плазмиду без вставки и бактерии с рекомбинантной плазмидой, содержащей вставку клонируемой ДНК. С другой стороны, требуется отыскать среди рекомбинантных клонов те, что содержат конкретные индивидуальные целевые последовательности, например, соответствующие гену, кодирующему определенный фермент. Последняя задача решается с помощью методов молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, полимеразной цепной реакции, анализа экспрессирующихся белков, и последующего молекулярного анализа рекомбинантных плазмид с помощью комплекса методов, в том числе рестрикционного анализа и секвенирования (определения последовательности нуклеотидов). Процесс отбора и сортировки клонов трансформированных бактерий называется скринингом, от английского to screen - просеивать, сортировать. Первичные

27

этапы скрининга, состоящие в отделении рекомбинантных клонов от нерекомбинантных и нетрансформированных, являются более простыми. Основное значение при этом имеют маркерные гены. Это вспомогательные гены, которые можно подразделить на селективные и репортерные.

Принцип работы селективных генов состоит в том, что в определенных условиях выживают только нужные исследователю клоны бактерий. Например, в качестве селективных маркеров наиболее часто используют гены устойчивости к антибиотикам, которые имеются практически во всех современных плазмидных векторах. Для трансформации этими плазмидами используют штаммы бактерий, чувствительные к данному антибиотику. При посеве бактерий, трансформированных лигазной смесью на основе плазмиды с геном устойчивости к антибиотику, на среде с этим антибиотиком исходные нетрансформированные бактерии, преобладающие в смеси, погибают и вырастают колонии только из бактерий, которые приобрели плазмиду в результате трансфекции.

Репортерные гены позволяют отличать содержащие и несодержащие их колонии визуально или с помощью простых тестов. Одним из самых удобных и часто употребляемых систем скрининга подобного типа является отбор рекомбинантных клонов с помощью цветной селекции с использованием плазмид типа Bluescript, называемой также системой бело-голубой селекции.

В основе цветной селекции трансформантов лежат свойства лактозного оперона Е. coli и способность β-галактозидазы Е. coli расщеплять добавленный в среду хромогенный субстрат X-gal (5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-О-галактозид), который окрашивает колонии, продуцирующие β-галактозидазу, в ярко-синий цвет.

28

На рисунке представлена схема лактозного оперона Е. coli. Он представляет собой последовательность, содержащую около 6000 пар нуклеотидов, и кодирует группу генов, ответственных за утилизацию лактозы. Ген lacZ кодирует β-галактозидазу (1021 аминокислота), гены lacY и lacA — два других фермента. Все три гена транскрибируются с промотора Р. Ген lacl транскрибируется независимо от этих трех генов с промотора Р_I и кодирует белок-репрессор, способный связываться с операторной зоной (О) гена lacZ и блокировать транскрипцию с промотора Р. Области промотора Р и оператора О перекрываются.

Белок-репрессор связывается либо с оператором, либо с индуктором. Природным индуктором оперона является аллолактоза, которая образуется при наличии в среде галактозы. Искусственный индуктор — IPTG (изопропилтиогалактозид). При связывании белка - репрессора с индуктором, он отделяется от области оператора и начинается транскрипция lас-оперона с промотора Р (и, следовательно, гена β-галактозидазы). Если нет индуктора, репрессор присоединяется к оператору и блокирует транскрипцию.

Важно, что активность промотора Р может искусственно регулироваться. Если поставить под контроль этого промотора нужный ген, то можно индуцировать его транскрипцию добавлением в среду IPTG. Необходимым условием при этом является способность клеток продуцировать белок-репрессор.

Для бело-голубой селекции трасформантов используют феномен так называемой α-комплементации, суть которой состоит в том, что неактивная β-галактозидаза с дефектом в N-концевой области и N-концевой пептид нормальной β-галактозидазы способны взаимодействовать и компенсировать дефект, что приводит к восстановлению ферментативной активности.

29

В плазмидах типа pBluescript содержится регуляторная область Р/О lас-оперона и N-концевой участок гена р-галактозидазы (первые 146 аминокислот из 1021). Для трансформации этими плазмидами используют клетки специальных штаммов E. coli, которые продуцируют дефектную мутантную по N-концу β-галактозидазу (обычно этот ген находится в эписоме — F-факторе) и репрессор — продукт гена lacI. В такой системе после добавления индуктора (IPTG) и субстрата (X-gal) образуется N-концевой пептид β-галактозидазы, происходит α-комплементация с дефектной β-галактозидазой, восстанавливается ферментативная активность фермента, он расщепляет X-gal, и колонии бактерий окрашиваются в голубой или синий цвет.

В плазмидах такого типа внутри последовательности а-пептида гена lac Z, ближе к N-концу находится полилинкер, позволяющий клонировать ДНК внутри гена lacZ. Полилинкер достаточно короткий и подобран таким образом, что его наличие само по себе не нарушает функционирования гена Вставка клонируемой ДНК в полилинкер приводит к разрыву гена lacZ и его инактивации, α-комплементации нет, β-галактозидазной активности нет, X-gal не расщепляется — в результате образуются белые колонии.

Система bluescript используется в целом ряде плазмид — KS, pGEM, pUC, pTZ, Binl9 и др.

При цветной селекции трансформантов надо иметь в виду следующее.

У α-пептида β -галактозидазы N-концевая часть не важна для функционирования и может быть заменена любой последователь­ностью аминокислот, поэтому полилинкер для клонирования располагают в самом начале N-концевой его части, и сконструирован он так, что рамка считывания гена р-галактозидазы сохраняется.

Нужно отметить, что при вставке относительно коротких олигопептидов возможно полное или частичное сохранение

30

α-комплементации и, следовательно, появление окрашенных (хотя и более слабо) колоний. Это происходит при условии сохранения рамки считывания при вставке и отсутствии в ней стоп-кодонов, что вполне вероятно для коротких последовательностей. В таких случаях эффективность бело-голубой селекции падает. Возможно появление ложных результатов и, поэтому требуется привлечение других методов для определения наличия и специфичности вставки.

Молекулярно-генетический анализ рекомбинантных клонов чаще всего начинается с рестрикционного анализа. Белые колонии после бело-голубой селекции засеваются в пробирки с 3 мл жидкой среды LB и инкубируются ночь при 37⁰. Плазмида, содержащая вставку, выделяется по методике, описанной в работе 1. Далее плазмида подвергается рестрикции теми же рестриктазами, что использовались при клонировании, как описано выше. Продукты рестрикции разделяются с помощью электрофореза для определения наличия вставки и её размера. Совпадение определенного по электрофореграмме размера вставки с теоретически ожидаемым является важным аргументом в пользу успешности клонирования.

Работа 5.

Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид с помощью электрофореза.

Обеспечение работы

Оборудование: суховоздушная качалка (37°С); суховоздушный термостат (37°С); центрифуга типа «Эппендорф»; автоматические пипетки на 2—20 мкл и 200—1000 мкл; наконечники для на 200 мкл и на 1000 мкл; прибор для горизонтального электрофореза с источником тока не менее

31

чем на 200 в, трансиллюминатор и/или система анализа изображений GelDoc фирмы BioRad.

Реактивы: агароза; 10х буфер ТВЕ; бромистый этидий (EtBr, 10 мг/мл); фенол; смесь фенол-хлороформ; спирт 70 и 96%; ТЕ-буфер; 80% глицерин с бромфеноловым синим; ампицилин (100 мг/мл); X-gal (20 мг/мл); IPTG (20 мг/мл);

Среды: среда LB жидкая.

Биологический материал: лабораторный штамм кишечной палочки, содержащий плазмиду с ослабленным контролем и селективными генами устойчивости к антибиотикам; колонии трансформированных бактерий, содержащие рекомбинантные плазмиды.

Ход работы

1. залить гели из легкоплавкой агарозы (концентрация агарозы - 1%; буфер - ТАЕ (0,04 М трис-ацетат - 0,002 М ЭДТА, рН 7,5—8,0) или ТВЕ; бромистый этидий добавляется до конечной концентрации 0,5 мкг/мл (4 мкл EtBr с концентрацией 10 мг/мл на 80 мл агарозы);

2. приготовить контрольные пробы, т.е. непорезанные плазмиды, смешав по 2 мкл каждой плазмиды (концентрация 0,1—0,2 мкг/мкл) с 1—2 мкл 80%-го глицерина с бромфеноловым синим (БФС).

3. по окончании рестрикции в каждую пробирку добавляют по 2 мкл 80%-го глицерина с БФС, перемешивают и наносят на агарозный гель содержимое каждой пробирки в две ячейки поровну. Рядом наносят контрольные пробы и какой-либо стандарт для определения размера фрагментов и ориентировочной оценки их концентрации.

4. электрофорез проводят при напряжении 80—100 В в течение 60—90 мин.

32

5. по окончании электрофореза изучают гель в УФ-излучении, фотографируют и переводят изображение на компьютер для анализа.

Оцените, как выглядят непорезанная и порезанная плазмида в геле. Отметьте 3 формы непорезанной плазмиды — суперспирализованную, с одиночным разрывом и линейную. В хорошо выделенной плазмиде максимум свечения наблюдается в суперспирализованной форме.

Рекомбинантная плазмида до рестрикции должна иметь больший размер, чем исходный плазмидный вектор, а после рестрикции давать две полосы – одну, соответствующую исходной разрезанной линейной плазмиде и вторую, соответствующую по размеру вставленному фрагменту ДНК.

Для определения размера (или молекулярной массы) фрагмента и оценки его концентрации можно воспользоваться лицензионными фирменными программами одномерного и двумерного анализа электрофореграмм, прилагаемых к прибору GelDoc фирмы BioRad. Однако для усвоения принципов такого анализа нужно построить калибровочную кривую и произвести расчет с её помощью, а полученные результаты сравнить с данными автоматического анализа.

Для этого измеряют расстояние на экране компьютера или с помощью линейки (в миллиметрах) на фотографии электрофореграммы от края ячейки до середины полосы каждого анализируемого фрагмента и каждого фрагмента стандартной пробы с известными размерами фрагментов.

Далее с помощью программы Exell или вручную на миллиметровой бумаге строят график зависимости логарифма молекулярной массы (или длины) фрагмента, lgM, от пройденной фрагментом дистанции R (измеренного расстояния полосы от края ячейки). График должен представлять собой прямую линию с отрицательным углом наклона, поскольку эти величины связаны следующим соотношением:

33

lgM = k/ R

где k - константа, характерная для данных условий опыта и общая для всех образцов, нанесенных на гель.

Пользуясь полученным графиком, по измеренным значениям R для анализируемых рестрикционных фрагментов находят для них значения lgM. Антилогарифм этих величин даст искомые молекулярные массы изучаемых фрагментов.

Интенсивность флуоресценции каждой полосы пропорциональна массе содержащейся в ней ДНК, поскольку бромистый этидий связывается (интеркалирует между основаниями) равномерно по всей длине ДНК, примерно одна молекула на 10 пар оснований. Поэтому можно примерно оценить концентрацию ДНК в наносимых пробах, сравнивая интенсивность их свечения со свечением полос стандарта, где известно содержание нуклеиновой кислоты в каждом фрагменте. Обычно определяют на глаз, какая из полос стандартного образца наиболее близка по свечению к анализируемому фрагменту и принимают, что количества ДНК в этих полосках равны. Такая оценка количества ДНК обычно оказывается достаточно точной для экспериментов по клонированию генов.

Электрофоретическое разделение ДНК можно использовать для очистки и выделения фрагментов ДНК для последующего переклонирования в другой вектор или создания более сложных генетических конструкций.

Для извлечения фрагмента ДНК из агарозного геля под ультрафиолетовой лампой чистым прокаленным скальпелем вырезают фрагменты геля. Кусочки агарозы, соответствующие одной полосе, объединяют и помещают в одну, предварительно взвешенную эппендорфовскую пробирку на 2 мл, определяют вес агарозы и замораживают для хранения или сразу заливают 5 кратным объемом ТАЕ или ТЕ буфера и осторожно плавят агарозу (конечная концентрация агарозы не должна превышать 0.2%). После двукратной экстракции примесей фенол-хлороформенной смесью,

34

ДНК осаждают двумя объемами этанола. Для полноты осаждения желательно добавить раствор какой-нибудь РНК в качестве носителя.

Кроме того, существуют специальные наборы реагентов для быстрого извлечения ДНК из агарозного геля. Они довольно дороги, но позволяют быстро, без потерь получить фрагменты ДНК достаточно высокой чистоты.

При работе с ультрафиолетовой лампой следует беречь глаза и кожу, работать в очках или с защитным экраном и не стоять над лампой долго.

Работа 6

Скрининг и анализ рекомбинантных клонов с помощью ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была предложена Кэри Мюллисом в 1983 году и очень быстро нашла широкое практическое применение. Важность этого метода была признана присуждением Нобелевской премии К. Мюллису.

Основные теоретические предпосылки этого метода состоят в следующем:

1. Все ДНК-полимеразы (как ДНК-, так и РНК-зависимые) в отличие от РНК-полимераз не могут начинать синтез новой цепи на «голой» матрице, а только достраивать 3’-конец олигонуклеотида, комплементарного матрице и заранее закрепленного на ней – говорят, что они нуждаются в затравке или праймере. Это свойство позволяет точно установить начальные точки синтеза ДНК при ПЦР.

2. Синтез новых цепей идет строго полярно от 5’- к 3’-концу, а движение фермента по матрице идет при этом в противоположном направлении от 3’- к 5’-концу, поскольку комплементарные цепи ДНК антипараллельны

35

3. для ПЦР требуются два праймера, подобранные к комплементарным цепям матрицы таким образом, чтобы синтез новых цепей с мест их прикрепления происходил навстречу друг другу.

Принципиальная схема ПЦР представлена на рисунке ниже:

Стрелками обозначены праймеры (затравки). Остриё стрелки соответствует 3’- концу праймера и одновременно указывает направление синтеза новой цепи. Самыми тонкими линиями обозначены исходные цепи анализируемой ДНК, более жирными – цепи ДНК, синтезированные после первого цикла реакции, самыми жирными – цепи, синтезированные во втором цикле. Цепи ДНК синтезированные в третьем цикле обозначены двойной линией.

Каждый цикл состоит из трех шагов:

1. Денатурация (плавление) – разъединение цепей ДНК путем нагревания до высокой температуры (92-98⁰)

2. Отжиг – комплементарное связывание праймера при понижении температуры

3. Элонгация (удлинение цепей) – синтез новых цепей ДНК комплементарных матрице, начиная с праймеров.

На схеме показаны результаты амплификации после 1-го, 2-го и 3-го циклов, а также комплементарное связывание праймеров на стадии отжига второго цикла. После первого цикла синтезируется две новых длинных цепи ДНК. После второго – образуется еще две длинных цепи и две коротких, которые образуются за счет встречного синтеза между двумя праймерами. После третьего цикла – общее количество новых длинных цепей доходит до шести, а коротких цепей до восьми, при этом появляются два первых коротких двуцепочечных фрагмента. В дальнейшем количество длинных цепей растет в арифметической прогрессии – прибавляется две цепи после каждого цикла, а количество коротких – экспоненциально, в том

37

числе, и двунитевых коротких фрагментов. После 10 циклов их число превышает тысячу, а после 20 – миллион. В итоге после нескольких десятков циклов обнаруживаются практически только короткие фрагменты, а количество длинных оказывается незначительным.

Если в матрице не содержится участков для комплементарного связывания праймеров – реакция не происходит. Поэтому образование специфического фрагмента является аналитическим подтверждением присутствия в пробе соответствующей матрицы ДНК и применяется для:

1. обнаружения патогенов (вирусов, грибов, бактерий, простейших),

2. обнаружения чужеродных генов (анализ генномодифицированных продуктов и клонов бактерий),

3. установления конкретных аллелей генов и выявления мутаций,

4. паспортизации сортов растений и пород животных

5. диагностики наследственных болезней

6. выявления свойств личности, в частности предрасположенности к болезням

7. идентификации личности, установление отцовства

8. выделения новых генов и последовательностей ДНК

9. молекулярного маркирования хромосом и других приложений.

Успешность проведения ПЦР зависит от многих факторов: правильного подбора праймеров, количества циклов, температурного режима и длительности каждого шага в цикле, количества и степени очистки ДНК-матрицы.

На стадии денатурации необходимо более длительное время для матриц с высоким содержанием G-C-пар: чем выше их

38

содержание, тем большее время или температура денатурации требуются для полной денатурации ДНК. Так, если при 95⁰С это 30 секунд, то для 97⁰С – 15 секунд. При этом учитывается, что время нагревания включает и нагрев самой пробирки. Продукты неполной денатурации легко могут вновь ренатурировать, что, резко снижает выход продукта реакции.

Однако слишком высокая температура денатурации или большая продолжительность этой стадии уменьшает активность самой Taq ДНК-полимеразы. Время полужизни фермента составляет при 97.5⁰С – 5 минут, при 95⁰С – 40 минут, при 92.5⁰С – 130 минут.

Крайне важен этап отжига праймера – температура и время отжига праймера зависят от его нуклеотидного состава, а также длины и концентрации праймеров в растворе. Обычно температура отжига ставится на 5⁰С ниже, чем температура плавления Т(м) данной последовательности.

Температура плавления определяется с помощью компьютерных программ или для праймеров длиной около 20 нуклеотидов приблизительно оценивается по формуле:

Т(м) = 4n (G+C) + 2 m (A+T)

n – количество G+C, m – количество A+T.

Для отжига праймеров, используемых в обычной концентрации 0.2 мкМ, необходимо всего несколько секунд. Соблюдение точной температуры отжига уменьшает вероятность неспецифичного связывания праймеров с матричной ДНК и элонгацию неправильно связанных праймеров. Особенно важно учитывать это на первых циклах ПЦР. Для максимальной специфичности необходимо добавлять фермент после первой денатурации цепи. В настоящее время для более точной амплификации ДНК используется технология горячего старта.

Существуют закономерности для подбора праймеров для стандартных анализов – длина их должна быть около 18-28 нкд,

39

в составе праймеров не должно быть больше 50-60% G-C пар, температуру отжига праймеров необходимо сбалансировать таким образом, чтобы она была промежуточной между Т отжига для каждого из пары праймеров, при этом желательно, чтобы температуры плавления праймеров различались не больше, чем на 5 – 10⁰. На 3’-конце праймера недопустимо наличие 3 и более GC-нуклеотидов. Желательно с помощью компьютерных программ (Oligo, Vector NTI и других) проверить отсутствие участков самокомплементарности праймеров (более 2 -3 нуклеотидов), особенно на 3’-конце. Часто при конструировании праймеров на 5’-конце для облегчения клонирования и экспрессии генов предусматривается вспомогательные последовательности: сайт рестрикции или ATG – старт кодон и т.д. Обычно при соблюдении этих требований температура отжига оказывается в пределах 50 – 65⁰.

На стадии элонгации должны быть созданы оптимальные условия для работы полимеразы. До 1987 года в качестве полимеразы в реакции использовался фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E.coli с температурным оптимумом 37⁰. Из-за тепловой денатурации фермента необходимо было добавлять в каждом цикле новую порцию фермента. После того, как для проведения ПЦР начали применять Taq ДНК-полимеразу, выделенную из термостабильной бактерии Thermus aquaticus, фермент можно добавлять однократно. Реакцию проводят в приборе – амплификаторе, что позволило автоматизировать и существенно упростить методику. В конечном итоге, методика приобрела ряд преимуществ, а именно: синтез стал более специфичен, увеличились выход и длина продукта, чему способствовал температурный оптимум фермента – 70⁰ - 75⁰ С.

При использовании ПЦР для скрининга бактериальных колоний или растений-регенерантов и других объектов на наличие соответствующей вставки чужеродной последовательности ДНК, сначала проводят выделение ДНК,

40

пользуясь методиками подходящими для каждого типа тканей и организмов. Для бактерий можно воспользоваться приведенной выше методикой выделения плазмид, если клонирование проводилось в плазмидном векторе. Но во многих случаях можно вообще не проводить специального выделения и очистки ДНК из бактерий, а просто добавлять в реакционную среду непосредственно бактерии из небольшой колонии. При высокой температуре происходит разрушение бактерий и часть ДНК выходит из клеток. Поскольку чувствительность ПЦР очень высока, этого может хватить для проведения реакции.

Ход работы

Приготовить реакционную смесь следующего состава:

1. дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), концентрация 0.5 mM – 2 мкл смеси или по 2 мкл раствора каждого нуклеотида

2. Taq ДНК-полимераза – из расчета 1 единица активности на пробу

3. ДНК – матрица – раствор с концентрацией ДНК 0.5 -0.05 мкг/мкл с общим количеством ДНК около 1 мкг или соскоб бактериальной колонии, взятый с помощью прокаленной препаровальной иглы

4. смесь праймеров – по 10 - 20 пM каждого праймера в объеме 20 мкл,

5. буфер 10х, например, содержащий для Taq-полимеразы следующие компоненты: 670 мМ Трис-НСl рН 8.8, 160 мМ NaHSO4, 15 mM MgCl₂, 0,1% Tween-20 – 2 мкл

6. автоклавированная дистиллированная вода – до объема 20 мкл

7. после перемешивания реакционной смеси, содержащей все компоненты, поверх водного слоя аккуратно наносится 50 мкл минерального (вазелинового) масла для предотвращения испарения при высокой температуре.

41

Протокол амплификации

Пробирки помещаются в автоматический амплификатор для ПЦР Ампли-4 (фирмы Биоком) или Терцик (фирмы ДНК-технология). Задается программа из 30 – 40 циклов со следующим температурным режимом:

1. Денатурация 94⁰, 1 минута

2. Отжиг 1 минута при температуре отжига, в зависимости от праймеров

3. Элонгация 72⁰, 0.5 – 1 минута.

Реакция занимает несколько часов, после чего реакционная смесь наносится на агарозный гель и подвергается электрофорезу, как описано в предыдущих работах. Появление полосы на электрофореграмме с длиной фрагмента, соответствующей ожидаемой, говорит о наличии нужной вставки ДНК.

Примечание: Как вариант данная работа может проводиться по методу ПЦР в реальном времени (Real Time PCR) с помощью прибора АНК-32. При этом в реакционную смесь добавляется дополнительно флуоресцентная олигонуклеотидная проба, комплементарная середине амплифицируемого участка. В этом случае повышается чувствительность и специфичность анализа, а время значительно сокращается.

Тема: Генетическая инженерия растений.

Генетическая инженерия – одно из наиболее перспективных направлений современной биотехнологии растений, целью которого является создание трансгенных растений, то есть растений, в геном которых внедрены гены других живых организмов, придающие растениям различные желательные свойства.

Среди большого числа методов трансформации растений наибольшей популярностью для двудольных растений

42

пользуются методы введения чужеродной ДНК с помощью Agrobacterium tumefaciens из-за их эффективности, удобства и простоты.

Эта бактерия является природным «генным инженером». Она содержит крупную Ti-плазмиду (tumor inducing), фрагмент которой (Т-ДНК) с помощью бактериальных белков переносится и встраивается в геном растительной клетки. Для обеспечения этого процесса важно только сохранение последовательностей нуклеотидов левой и правой границ Т-ДНК, примерно по 20 – 25 нуклеотидов. Вся внутренняя область Т-ДНК может быть заменена любой искусственной генетической конструкцией, которую требуется ввести в геном растения.

Поэтому наиболее популярными генетическими векторами для растений являются бинарные и коинтегративные векторы, представляющие собой плазмиды с фрагментами Т-ДНК и вспомогательными последовательностями. Бинарные векторы содержат соответствующие последовательности начала репликации и могут поддерживаться как в E. coli, так и в A. tumefaciens. Вся работа по созданию генетической конструкции осуществляется с помощью E. coli и только готовая векторная плазмида переносится в агробактерию.

Агробактерия осуществляет трансформацию клеток на раневых поверхностях, поэтому для введения ДНК в клетки используют свежевыделенные экспланты и наносят дополнительные повреждения – рассекают жилки, обрезают кромки листьев. Чтобы регенерация растений происходила преимущественно из трансформированных клеток, обычно используют вспомогательные селективные гены. Как правило, они представляют собой гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам. При помещении эксплантов обработанных агробактерией, на среды с такими веществами, очаги регенерации образуются из устойчивых (трансформированных) клеток, но общая частота регенерации падает в несколько раз по

43

сравнению с контрольным вариантом без селективного фактора. Поэтому для успешной трансформации требуется высокоэффективная система регенерации. Вполне удовлетворяет этим требованиям разработанная нами система регенерации-трансформации на основе листовых эксплантов малины.

Работа 7. Получение трансгенных растений малины, несущих ген npt II, кодирующий признак устойчивости к канамицину.

Материалы и оборудование: Стерильные чашки Петри, спиртовые растворы фитогормонов, стерильные растворы антибиотиков, пинцеты, скальпели, ламинарный бокс, спиртовка, инструменты для стерильной работы.. В работе используется питательная среда на основе минеральной части среды Мурасиге – Скуга с органическими компонентами следующего состава (мг/л):

Сахароза 30000 Инозит 100

Аскорбиновая к-та 1.0 Пиридоксин (В6) 0.5

Никотиновая к-та 1.0 Тиамин (В1) 0.1

Цитокинин (TDZ) 0.2 Агар-агар 7000

Без антибиотиков и с антибиотиками.

Биологический материал: суспензионная культура (в жидкой среде LB) A. tumefaciens с генетической конструкцией в Т-ДНК, кодирующей признак устойчивости к канамицину; пробирочные растения малины сорта Бабье лето – 2 или другого сорта с высокой регенерационной способностью. Желательно использовать растения на стадии укоренения, поскольку они обладают более благоприятным гормональным балансом.

Ход работы

1. В стерильные пробирки или чашки Петри разливается среда для регенерации, не содержащая антибиотиков,

но с добавлением тидиазурона в концентрации 0,1 мг/л.

44

2. Верхние три листочка, начиная с самого верхнего почти полностью развернувшегося листа, удаляют с растения и их края обрезают, на крупных жилках делают насечки для получения раневых поверхностей.

3. Полученные листовые экспланты обмакивают в бактериальную суспензию и помещают на поверхность среды для регенерации. Оставшаяся часть растения возвращается в пробирку.

4. Через сутки экспланты переносят в другую чашку с такой же средой, но с добавлением антибиотиков: цефатоксима в концентрации 200 мг/л и канамицина - 5 мг/л.

5. Чашки с эксплантами помещают в темное место на 10 дней.

6. Отмечают образование каллуса на раневых поверхностях и признаки морфогенеза, а затем переносят чашки на свет.

7. Через месяц производят подсчет очагов регенерации (побегов, стеблевых почек, эмбриоидов).

8. Результаты оформляют в виде таблицы, где указывают количество эксплантов, очагов регенерации, побегов-регенерантов и их количество в расчете на эксплант.

9. Побеги размером свыше 5 мм отделяют и помещают на питательную среду того же состава, но с концентрацией канамицина 15 мг/л, для второго этапа селекции.

10. Через несколько недель отмечают побледнение и отмирание некоторых побегов.

11. Устойчивые к канамицину побеги переносят на среды для клонального микроразмножения, затем укореняют и изучают свойства полученных растений.

12. В качестве дополнительного доказательства наличия трансгена в растениях проводят выделение из них ДНК и ПЦР с праймерами специфичными для гена npt II, согласно методикам, приведенным в методических пособиях.

45