Задание для самостоятельной работы:

1. Две различные рестриктазы, узнающие последовательность в 4 и 6 нуклеотидов, образуют одинаковые липкие концы длиной 4 нуклеотида. Нарисуйте схему и определите, какие рестриктазы смогут расщепить последовательность, полученную после слипания и сшивки гетерологичных фрагментов?

2. Две рестриктазы, узнающие различные последовательности, образуют разные липкие концы длиной 4 нуклеотида, у которых по два концевых нуклеотида комплементарны. Нарисуйте схему и определите, сможет ли лигаза восстановить непрерывность цепей ДНК после слипания гетерологичных фрагментов?

19

Тема: Основные принципы создания искусственных рекомбинантных генетических конструкций

Создание искусственных генетических конструкций является одним из ключевых элементов создания трансгенных организмов, средств генной терапии, выделения и изучения генов. Иногда этот процесс является многоэтапным, включает целый ряд переклонирований и требует разработки уникальных приёмов. Но обычно даже самые сложные схемы работы являются комбинацией нескольких стандартных подходов, в частности, лигазного, коннекторного и линкерного методов. Наиболее часто применяется лигазный метод, но первым в историческом плане был разработан коннекторный метод.

Коннекторный метод

Коннекторный метод разработали и использовали в 1972 г. П. Берг с сотрудниками, которые впервые сообщили о получении in vitro гибридной молекулы, состоящей из фрагментов плазмиды, ДНК вируса SV40 и ДНК фага λ.. Принцип одного из вариантов этого метода показан на схеме и заключается в следующем.

К 3'-концам одного из рекомбинируемых in vitro фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достраивают одноцепочечные олиго(dА)-сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента — олиго(dТ)-сегменты примерно такой же длины. При смешении полученных таким образом фрагментов формируются кольцевые структуры за счет водоро дных связей между олиго(dА)- и олиго(dТ)-последовательностями. Одноцепочечные бреши гибрид­ных молекул ДНК застраивают с помощью ДНК-полимеразы I E. coli и цепи ковалентно сшивают в лигазной реакции.

Коннекторным методом удается рекомбинировать in vitro фрагменты ДНК, полученные любым из способов расщепления исходной ДНК (механическим, ферментативным). При этом используют синтетические комплементарные олиro(dA) • олиго(dТ) или олиго(dG) • олиго(dС) концы. Поскольку можно формировать

20

достаточно длинные взаимокомплементарные одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью. В частности, поэтому при клонировании ДНК-копий матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах, обычно используют коннекторный метод.

Однако этот метод имеет недостатки. Часто выделение встроенного фрагмента из гибридной молекулы ДНК затруднено. В ряде случаев удается подобрать условия для избирательной денатурации олиго(dА • dТ)-последовательностей, по которым состыкованы фрагменты ДНК, и расщепить образовавшиеся одноцепочечные участки эндонуклеазой S1.

При рекомбинации in vitro фрагментов ДНК, генерированных рестриктазой Pst l, с использованием синтетических олиго(dG) • олиго(dС)-концов участок узнавания этой рестриктазы восстанавливается и встроенный фрагмент можно уже достаточно просто выщепить из гибридной молекулы с помощью рестриктазы Pst l. Однако кроме целевой

21

последовательности данный фрагмент имеет дополнительные концевые сегменты олиго(dG • dC).

Рестриктазно-лигазный метод

Более простой и самый популярный метод получения in vitro гибридных молекул ДНК — рестриктазно-лигазный. Первые гибридные молекулы ДНК получили этим методом С. Коэн с сотрудниками в 1973 г.

Данный метод состоит в следующем (схема 2):

1) рестриктазой класса II специфически разрезают молекулы ДНК на фрагменты, имеющие идентичные взаимокомплементарные липкие концы

2) препараты различных молекул ДНК, гидролизованных одной и той же рестриктазой, смешивают, и при определенных условиях липкие концы разных фрагментов ДНК реассоциируют за счет комплементарного взаимодействия;

22

3) с помощью ДНК-лигазы происходит ковалентное связывание ассоциированных фрагментов ДНК.

По такой схеме могут быть ковалентно соединены in vitro два и более любых фрагмента. полученных при гидролизе молекул ДНК одной и той же рестриктазой. Однако с помощью рестриктаз (особенно одного фермента) в каждом конкретном случае можно получить лишь специфический, строго определенный набор фрагментов изучаемой ДНК. Первоначально это в некоторой степени ограничивало применение рестриктазно-лигазного метода.

Но затем получила распространение новая его модификация, основанная на искусственном введении рестрикционных последовательностей с помощью линкерных молекул — синтетических сегментов ДНК, содержащих в своем составе последовательности, узнаваемые рестриктазами. Метод

23

предложили Р. Шеллер с сотрудниками в 1977 г. Он позволяет достаточно просто рекомбинировать in vitro практически любые фрагменты ДНК.

Разработанный подход включает следушие операции (схема 3):

1. по тупым или липким концам фрагмента ДНК, который предполагается рекомбинировать, с помощью лигазы фага Т4 пришивают короткие синтетические двухцепочечные сегменты, имеющие участки узнавания определенной рестриктазы;

2. полученный фрагмент обрабатывают выбранной рестриктазой, в результате чего образуются липкие концы;

Понятно, что при всех трех упомянутых способах клонирования возможно образование исходной плазмиды, рекомбинантных молекул с различной ориентацией вставок, всевозможных димеров и других комбинаций (схема 4).

Схема 4. Продукты рекомбинации образующиеся после лигазной реакции.

24

Для уменьшения количества побочных продуктов, особенно восстановленной исходной плазмиды, и повышения эффективности клонирования разработан ряд дополнительных приемов, например:

1. После расщепления рестриктазой линейная плазмида обрабатывается ферментом фосфатазой, которая отщепляет фосфатные группы, остающиеся на 5^’-концах разреза после действия рестриктазы. Такая дефосфорилированная молекула может свернуться в кольцо за счет липких концов, но лигаза не может зашить разрывы и восстановить фосфодиэфирные связи, поэтому исходная плазмида не образуется и не участвует в трансформации

2. Проводят клонирование с использованием плазмиды, расщепленной сразу двумя различными рестриктазами, образующими разные липкие концы. При этом становится возможной вставка только тех фрагментов ДНК, которые также имеют разные липкие концы, образованные теми же двумя рестриктазами. Причем вставка происходит в однозначно определенной ориентации и количество продуктов резко сокращается.