Раздел 11

Схема постановки РГ (ингредиенты) (2):

При постановке реакции гемолиза используют бараньи эритроциты, гемолитическую сыворотку, содержащую специфические к ним гемолизины, и комплемент.

РСК (3):

Цели исследования (4):

Используется для выявления специфических антител по известному антигену или для определения антигена по известным антителам.

Ингредиенты (5):

I системы (6):

Антиген, антитело, комплемент

II система (7):

Эритроциты барана, сенсибилизированные (обработанные) гемолитической сывороткой, содержащие специфические к ним антитела.

Модификации реакции (8):

Радиального гемолиза в геле (9):

Реакция ставится в чашках Петри, в которые вносится агаровый гель, содержащий комплемент и эритроциты барана. После застывания агара в пластинке делают лунки, которые заполняются специфической гемолитической сывороткой. Реакцию учитывают по зонам гемолиза, образующимся вокруг лунок. Размеры их будут варьировать в зависимости от титра антител в исследуемой сыворотке. При использовании реакции радиального гемолиза в диагностие инфекционных болезней эритроциты барана «нагружают» специфическими антигенами, а в агаровые лунки вносят сыворотку больных.

Локального гемолиза в геле (10):

Используя данную реакцию, в агаровый гель вносят эритроциты барана и суспензию антителпродуцирующих клеток, после чего наслаивают на питательную среду комплемент. Результаты учитывают по образованию зон гемолиза вокруг отдельных плазмоцитов, секретирующих антитела к эритроцитам барана. Метод дает возможность установить наличие антителобразующих клеток в разных органах и тканях иммунной системы при воздействии на организм антигенов и иммуномодуляторов.

Титрование комплемента, антигена (11):

Необходимость в титровании комплемента диктуется тем, что его содержание в крови морских свинок непостоянно. Для этого основной раствор комплемента (1:10) разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5 мл и в каждую из них прибавляют 0,85%-ный раствор натрия хлорида, доводя объем до 1,5 мл. пробирки ставят в термостат при температуре 37˚С на 45 мин, после чего к ним добавляют гемолитическую систему и вновь инкубируют в термостате 30 мин. Затем определяют титр комплемента – его наименьшее количество, вызывающее гемолиз. Необходимость в титровании антигена, используемого в РСК, связана с тем, что он может адсорбировать некоторое количество комплемента, т.е. обладать антикомплементарными свойствами. Для определения титра антигена его разливают в ряд пробирок в уменьшающихся дозах от 0,5 до 0,05 мл и добавляют 0,85%-ный раствор натрия хлорида, доводя объем жидкости до 1 мл. затем в каждую пробирку доливают по 0,5 мл рабочей дозы комплемента и помещают их в термостат на 1 ч при температуре 37˚С. После этого во все пробирки прибавляют по 1 мл гемолитической системы, вновь инкубируют в термостате 1 ч и учитывают результаты. Титром антигена считается его наименьшая доза, при которой наступает полный гемолиз. В РСК используют рабочую дозу антигена, составляющую примерно ½-2/3 титра. Если титр комплемента в присутствии антигена снижается более чем на 30%, то он непригоден для реакции.

Этапы постановки (12):

Для опыта берут три пробирки, в каждую вносят по 0,5 мл соответствующих ингредиентов. На начальном этапе в первую (опытную) наливают все три компонента РСК-сыворотку, антиген, комплемент; во вторую – сыворотку, комплемент, а вместо антигена – изотонический раствор натрия хлорида (контроль сыворотки); в третью – антиген, комплемент, а вместо сыворотки – тот же раствор натрия хлорида (контроль антигена). Пробирки ставят в термостат при температуре 37˚С на 1ч. На втором этапе реакции в каждую пробирку вносят гемолитическую систему, и после перемешивания пробирки вновь помещают в термостат на то же время, а затем учитывают результаты РСК.

Учет (13):

Интенсивность реакции отмечается плюсами: «++++» - полная задержка гемолиза, жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты оседают на дно (резкоположительная РСК); «+++», «++» - слабый гемолиз, уменьшенное количество эритроцитов в осадке (положительные РСК); «+» - выраженный гемолиз, жидкость окрашена в розовый цвет, незначительное количество эритроцитов в осадке (слабоположительная РСК). Отрицательная РСК отмечается минусом: «-». При этом наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет цвет артериальной, или «лаковой» крови.