Раздел 9

Реакция агглютинации (1):

Агглютинацией называется склеивание микробов (клеток) при действии на них специфических антител в присутствии электролита.

Цели использования (2):

Реакцию агглютинации (РА) используют в серотипаже микроорганизмов, главным образом, бактерий и риккетсий и в серодиагностике инфекционных болезней.

Ингридиенты (3)

1. Антиген (агглютиноген);

2. Антитело (агглютинин);

3. Электролит (изотонический раствор натрия хлорида)

Агглютинирующие сыворотки (4):

Для получения агглютинирующих сывороток иммунизируют кроликов. Через неделю определяют титр сыворотки – максимальное ее разведение, которое агглютинирует гомологичный микроорганизм. Если титр сыворотки недостаточнее, иммунизацию продолжают.

Неадсорбированные (5):

Неадсорбированные сыворотки содержат групповые агглютинины и могут в небольших разведениях склеивать родственные с антигеном отношении бактерий. Поэтому для определения вида бактерий надо ставить развернутую реакцию с сывороткой, разведенной от 1:100 до ее титра. Сыворотка соответствует микробу в том случае, если агглютинирует его, как минимум, до половины титра.

Адсорбированные (монорецепторные) (6):

Более достоверные результаты при определении вида или серовара бактерий дают адсорбированные (монорецепторные или типоспецифические) сыворотки, которые не имеют групповых агглютининов, вследствие чего нет необходимости их сильно разводить, и реакцию агглютинации в них ставят на предметном стекле.

Виды реакций (7):

Обычная (классическая) (8):

Для идентификации микроорганизмов (9):

Обычно клинический диагноз подтверждает наличие агглютината в титре 1:200 и выше. При агглютинации бактерий в более низких титрах сыворотки, которая может происходить за счет нормальных антител, имеющихся у здоровых людей или больных с другим заболеванием, реакцию агглютинации ставят повторно, спустя 3-4 дня.

Ориентировочная (10):

Пластинчатая, или ориентировочная, РА ставится при комнатной температуре на предметном стекле. Для этого пастеровской пипеткой на него наносят раздельно каплю сыворотки в разведении 1:10-1:20 и контрольную каплю изотонического раствора натрия хлорида. В ту и другую бактериальной петлей вносят колонии или суточную культуру бактерий (каплю диагностикума) и тщательно их перемешивают. Реакции учитывают через несколько минут визуально, иногда с помощью лупы (х5). При положительной РА в капле с сывороткой отмечают появление крупных и мелких хлопьев, при отрицательной – сыворотка остается равномерно мутной.

Микроагглютинация (11):

В некоторых случаях, когда для агглютинации берется небольшое количество бактерий и учесть ориентировочную РА из-за этого трудно, капли сыворотки с внесенной в нее культурой высушивают, фиксируют, окрашивают фуксином Пфейффера и микроскопируют. При положительной РА во многих полях зрения микроскопа наблюдаются большие скопления бактерий, при отрицательной – бактерии распределены в мазке равномерно.

Развернутая (12):

Ее ставят следующим образом. В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. А первую из них доливают 1 мл неадсорбированной сыворотки, разведенной 1:100, и, перемешав, 1 мл переносят во вторую, из второй – третью и т.д. Получив двукратные разведения диагностической сыворотки от 1:100 до 1:1600 и более, в них вносят по 1-2 капле 2-миллиардной взвеси бактерий. Контролями служат изотонический раствор хлорида натрия с антигеном и исследуемая сыворотка без него. Пробирки энергично встряхивают и помещают на 2ч в термостат при температуре 37˚С, затем осуществляют предварительный учет, начиная с контролей. Отсутствие агглютинации в контроле и наличие взвешенных хлопьев в двух-трех и более пробирках опыта свидетельствуют о положительной реакции. Окончательные результаты учитывают через 18-20 ч, выдерживая штатив с пробирками при комнатной температуре. Интенсивность реакции выражается плюсами: «++++» - сыворотка прозрачная, с хлопьевидным осадком склеившихся бактерий на дне пробирки; «+++», «++», и «+» - убывающие просветления с уменьшением бактериального осадка. Жгутиковые бактерии агглютинируются в виде рыхлых легко взбиваемых хлопьев спустя 2 ч, а безжгутиковые бактерии и риккетсии склеиваются через 18-20 ч с образованием мелкозернистых трудноразбиваемых при встряхивании осадков.

Для серодиагностики инфекционных болезней (13):

Обнаружение в сыворотке больных антител к определенным видам патогенных микроорганизмов – косвенный, но очень важный диагностический показатель. Техника постанови развернутой РА для серодиагностики инфекционных болезней такая же, как и в серотипаже. Получив сыворотку больных, ее, как и диагностическую, разводят изотоническим раствором натрия хлорида от 1:100 до 1:1600. В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы – заведомо известные взвеси убитых бактерий, с которыми безопасно работать.

Модификации (14):

РНГА (15):

РНГА (реакция непрямой гемагглютинации) для серодиагностики инфекционных болезней: используют для обнаружения антител в сыворотках больных, готовят эритроцитарные антигенные диагностикумы. Для этого бараньи эритроциты в течение 15 мин обрабатывают раствором танина в разведении1:20 000-1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют 2ч при температуре 37˚С. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2-3 раза отмывают 0,85%-ным раствором натрия хлорида и в количестве 0,1-0,25 мл 0,5%-ной взвеси добавляют к сываротке, разведенной от 1:10 до 1:1280 и разлитой по 0,25-0,5 мл в лунки планшет. В качестве контроля используют взвеси интактных и нагруженных специфическим антигеном эритроцитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо отрицательную и положительную реакции. Результаты учитывают через 2 ч после инкубации в термостате. РНГА оценивают плюсами : «++++» - эритроциты равномерно покрывают всю лунку планшеты в виде зонтика с неровными краями, «+++» и «++» - осадок эритроцитов в виде зонтика, в центре небольшое кольцо из несклеившихся эритроцитов, «+» - в основном несклеившиеся эритроциты. При отрицательной реакции эритроциты спонтанно агглютинируют в виде плотного диска на дне лунок.

РНГА для идентификации высокодисперсных антигенов. Применяя ее в определении видовой принадлежности антигенов, готовят антительный диагностикум, сорбируя на эритроцитах иммуноглобулины известной иммунной сыворотки. Параллельно в лунках полистироловых пластин делают двухкратные разведения антигена в объеме 0,25-0,5 мл и к каждому из них добавляют 0,1-0,25 мл сенсибилизированных антителами эритроцитов. Учет и оценка антительной РНГА для идентификации антигенов производится в те же сроки и по тем же показателям, которые используются в аналогичной ей реакции для серодиагностики болезней.

Реакция Кумбса (16):

С помощью этой РА выявляют неполные антиэритроцитарные антитела при анемиях, вызванных системными заболеваниями крови, коллагенозах, резус-конфликте. Различают прямую и непрямую реакции Кумбса.

Прямая реакция Кумбса позволяет выявлять неполные антитела, фиксированные на эритроцитах больных. Для их обнаружения каплю 5%-ной взвеси эритроцитов, трижды отмытых теплым изотоническим раствором натрия хлорида, вносят в каплю антиглобулиновой сыворотки, полученной иммунизацией кроликов глобулинами человека. Результат учитывают через 5-15 мин. В качестве контроля служит реакция с одногруппными эритроцитами заведомо здорового человека.

Непрямая реакция Кумбса выявляет свободные неполные антиэритроцитарные антитела. Их адсорбцию осуществляют 5-10%-ной взвесью трижды отмытых эритроцитов 0-группы крови здорового человека, которые прибавляют к трем частям исследуемой сыворотки больных. Смесь ставят в термостат при температуре 37˚С на 1 ч. Трижды отмытые эритроциты добавляют затем к антиглобулиновой кроличьей сыворотке.