7.1. Основные фазы роста и развития микробной культуры при периодическом культивировании.

Фазы роста:

1. Лаг-фаза. Наступает с момента засева клеток в питательную среду. Клетки не делятся. Культура адаптируется к новой среде. Клетки могут увеличиваться в размерах. Часть клеток может гибнуть и тогда численность популяции уменьшается.

2. Ускорение роста. За счет деления клеток начинается рост, но размножение медленное. Клетки крупные. Происходит интенсивный синтез веществ в клетке. Клетки наиболее чувствительны к изменениям среды и условиям культивирования.

3. Экспоненциального роста (логарифмического). Рост наиболее интенсивен. Скорость размножения наибольшая. Время генерации наименьшее. Относительный прирост биомассы наибольший. Клетки также чувствительны к изменению факторов среды и условий культивирования.

4. Замедления роста. Относительная скорость роста падает, общее количество клеток растет. Начинает увеличиваться время генерации. Часть клеток переходит в состояние покоя или гибнет.

5. Стационарная фаза. Концентрация биомассы достигает некоторой максимальной величины. Концентрация клеток не изменяется. Количество вновь появившихся уравновешенно количеством погибших. Клетки более устойчивы к физическому воздействию.

6. Фаза отмирания. Число погибающих клеток превалирует. Концентрация биомассы снижается. Морфологические и физиологические изменения клеток.

7. Фаза выживания (не всегда). Среди множества погибших, отдельные сохраняют жизнеспособность и могут обладать полезными признаками.

Продолжительность каждой фазы меняется от 0 до нескольких дней.

а- кол-во биомассы, (живые и мертв клетки) нет лаг периода, клетки не делятся, растут, но не делятся

б- кол-во живых клеток

в- общее кол-во клеток

Лаг-фаза роста культур микроорганизмов, влияние различных факторов на ее продолжительность.

Часто включают в лаг-фазу фазу ускорения роста.

Начинается с момента засева и заканчивается в момент вхождения в экспоненциальную фазу. V 0>max. M 0>max.

Продолжительность фазы является характеристикой роста популяции и зависит от возраста клеток иннокулята, величины засева, состава питательной среды, физико-химических показателей (pH, T, ок-вост. потенциал).

Влияющие факторы:

1. Природа м/о. Между продолжительностью лаг-периода и временем генерации существует четко выраженная корреляция. Чем меньше время генерации, тем короче продолжительность лаг-фазы. Это справедливо для клеток одного м/о выращенных в разных условиях и для представителей разных видов, выращенных в одинаковых условиях.

2. Возраст иннокулята. Чем моложе культура, тем короче лаг-фаза и наоборот. Культуры находящиеся в лаг- и экспоненциальной фазах – это физиологически молодые культуры.

3. Состав среды. Лаг-период может исчезнуть, если в питательную среду добавить фильтрат засевной культуры.

Изменение в питательной среде источников азота, углерода и т.д. обычно приводит к увеличению лаг-фазы за счет времени необходимого для синтеза новых ферментов. При пересеве если вести культивирование с исключением резких перепадов от иннакулята к основной среде, то исчезает или резко сокращается и лаг-фаза.

4. Величина засева. При культивировании на одной и той же среде продолжительность L пропорциональна величине засева. Если штамм не накапливает вещества необходимые для вовлечения субстрата в обменные процессы, то величина засева не оказывает влияния на продолжительность L. Если сделать слишком большой засев, то типичной кривой роста можно не получить из-за недостатка кислорода, быстрого накопления продуктов обмена и т.д.

Определение продолжительности. Можно графически. Продолжить линию экспоненциальной фазы до точки пересечения с минимумом. От 0 до пересечения – L.

Экспоненциальная фаза роста.

Начинается с того, что клетки адаптировались к заданным условиям, рост культуры не ограничивается ни недостатком питательных веществ, ни избытком продуктов обмена. Устанавливается максимальная скорость роста. Время удвоения и генерации минимальны. Рост биомассы описывается уравнением: x=x₀∙exp(M_max∙t). Скорость прироста биомассы в любой данный момент пропорциональна имеющейся в это время биомассе. Логарифм числа популяции увеличивается с постоянной скоростью.

Процессы роста в этой фазе протекают сбалансировано. Удвоение биомассы сопровождается удвоением ДНК, РНК, количества белка. Однако при отборе проб через короткие промежутки времени происходит колебания ряда параметров. Таким методом относят м/о к разным таксонометрическим группам. Это явление связано с активностью ферментов и приводит к колебаниям уровня клеточных метаболитов. Рост клеток с экспоненциальной скоростью обычно заканчивается через короткий промежуток времени. Продолжительность этого периода зависит от величины засева. Но величина засева не оказывает влияния на удельную скорость роста и время генерации.

Рост с экспоненциальной скоростью можно продолжить, отбирая часть культуры и заменяя ее свежей питательной средой.

Иногда рост в экспоненциальной фазе обрывается поскольку источник С оказывается исчерпан, а остальные элементы среды находятся в избытке.

Диауксия – явление, когда кривая роста характеризуется 2 фазами экспоненциального роста (2 источника С). Между ними как правило присутствует лаг-фаза. При этом интенсивность роста клеток по значению M, времени генерации в 1 фазе выше, чем во 2. Это явление связано с репрессией источником С синтеза ферментов связанных с метаболизмом второго. Кроме того есть данные регрессии транспорта второго источника С. Эти явления могут существовать одновременно. Если есть лимитирование по источнику С, то оба источника С могут потребляться одновременно.

Фаза замедления роста. Характеристика стационарной фазы.

Замедление роста вызывается тем, что с увеличением биомассы сказывается недостаточное количество питательных веществ в среде и происходит ингибирование продуктами обмена.

Скорость прироста биомассы постоянно. Линейный рост.

В фазе замедления роста популяция клеток становится гетерогенной усиления силу у не благоприятных условий: исчерпание субстрата, накопление ингибиторов. Все это приводит не только к замедлению роста, но и отмиранию клеток.

Для оценки эффективности роста в этой среде иногда применяют показатель эффективности в фазе замедленного роста M=M/M_max.

Фаза замедленного роста может полностью отсутствовать в среде, где концентрация одного из компонентов очень низкая.

Фаза стационарного роста.

Прекращается рост биомассы. Однако происходит не значительный прирост биомассы из-за размножения части клеток. Процесс размножения уравновешивается процессом гибели, поэтому число живых клеток не увеличивается, а количество биомассы продолжает возрастать.

Культура достигает максимальных величин по количеству клеток и по биомассе. Гетерогенность популяции еще выше. Интенсивность обменных процессов падает. В этой фазе м/о характеризуются большей устойчивостью к неблагоприятным факторам.

Переход в стационарную фазу определяется количеством лимитирующего субстрата в среде, накоплением продуктов метаболита, максимальной плотностью упаковки биомассы.

7.2. Хранение микроорганизмов. Подготовка посевного материала в биотехнологических производствах.

Задачи: 1) поддержание жизнеспособности; 2) сохранение таксометрических свойств; 3) сохранение полезных признаков.

Методы хранения:

Периодические пересевы (субкультивирование) (спорогенны 1 в 2-3 мес., аспорогенны 1-2 раза в мес.) после периода экспоненциального роста в начале стационарной фазы переносят на хранение: темнота, t=5ºC

«-» 1) возможность заражения; 2) трудоемкость; 3) расход реактивов; 4) возможность понижения ценных признаков.

Д/удлинения срока сохранности используют вазелиновое масло. Способ простой, не требует специальных приспособлений. Масло стерилизуют при 1 атм, 60 мин., потом прогревают в сушильном шкафу при 150ºC или при комнатной температуре 2-3 суток. Тогда пересевы осуществляются 2-2 раза в год.

• Криобиология. Готовят чистую суспензию м/о от 10⁴ до 10¹² клеток на мл, культура в начале стационарной фазы. В небольших лабораториях в качестве криагентов используют смесь снега с NaCl (9:1) -21ºC или смесь льда с CaCl₂ (2:1) -56ºC или тв. углекислоты -78ºC. Замораживание ведут в сосудах Дюара. Д/хранения используют рефрежираторы с азотом, газофазные -130-170 ºC и жидкофазные -190 ºC. Режим охлаждения 2-х этапный : сначала 1ºC/мин до -32ºC, второй 15-30 ºC/мин до -150 ºC. Большое значение имеет подбор среды д/предварительного выращивания. Кроме этого используют криопротекторы: 10-20% глицерин, 10-20% р-р глюкозы, белки. Они защищают клетку от повреждений. Более устойчивы Г⁺. Реактивируют м/о на водяной бане при +30+45ºC. Используется метод д/различения вирусов, заквасок, бактерий, дрожжей, спирахет и некоторых автотрофов. «+» 1) небольшое количество материала, 2) отсутствует заражение; 3) сохранение свойств; 4) небольшие затраты времени. «-» наличие специального оборудования. Сохранность при низких температурах 2-5 лет, а в азоте 10-30 лет.

• Леофилизация. Используется в крупных колониях бактерий, вирусов, плазмы крови. Дорогой способ. Это высушивание из замороженного состояния под вакуумом минуя жидкую фазу. При этом способе большое значение имеют криопротекторы, защищающие клетку от разрушения. Криопротекторы – глюкоза, сахароза, глютомат/аспартат Na, сыворотка крови, белки, молоко, желатин, крахмал. Часто используется смесь (1% желатина и 10% сахарозы). Готовят чистую суспензию 10⁸, разливают в ампулы, охлаждают при -20ºC и высушивают при -26ºC в течении 5-6 часов и досушивают 2 часа. Деактивация – медленное добавление воды и иногда мясного бульона, органических кислот и начинается лаг-период.

Хранение в высушенном состоянии. При влажности 10-12% рост м/о прекращается, при влажности 2-5% биохимические процессы сохраняются, но вода остается только в связанном состоянии. Сушку лучше переносят спорообразующие м/о. Высушивание м/о ведут на различных адсорбентах, стерильной почве, бумаге, тканях, крахмале, кристаллах сахарозы. Процесс можно вести под вакуумом. Густую суспензию смешивают с 10% р-ром желатина и смесь высушивают. Реактивация заключается в увлажнении и восстановлении численности путем высаживания на благоприятной почве (пекарские дрожжи, бак-удобрения)