3.3. Биотехнология получения витаминов на примере витамина b12.

Органич. низ. молек. в., участв. в биохим. реакц, обеспеч. обмен веществ.

Жирорастворимые: А, Е, D, K.

Водорастворимые: С, Н, B1, B2, B6, B12.

Методы получения:

1) Экстракция из раст. и жив. сырья.

2) Хим. синтез – преимущ.

3) Биосинтез – сложн. строения, хим. синт невозможно (B2, B12, D2)

Витамин B₁₂ — а-(5,6-диметилбензимидазолил) кобамид цианид представляет собой октаэдральный кобальтовый комплекс с шестью лигандами. Молекула витамина состоит из кобальтопиримидинового цикла в виде шести­основной кислоты или фактора В и из 5,6-диметил-бензимидазол-нуклеотида. Витамин представляет собой диэфир фосфорной кислоты, в котором свободный отрицательный заряд фосфорной кислоты нейтрализован одним положительным зарядом атома кобальта. Применяют при лечении пернициозной анемии, яз­вах желудка и двенадцатиперстной кишки, гастрите, болезни Боткина, при лечении нервных и психических расстройств, кост­ных переломах. Коферментная форма обладает высоким терапевтическим эффектом.

Питательная среда для культуры:

Барда, Глюкоза, CaCO3, CoCl2_*6H₂O.

Streptomyces olivaceus, Propionibacterium, Bacillus megatherium. Streptomyces olivaceus-аэробный микроб, хорошо растет на средах, содержащих углеводы, минеральные соли и органи­ческие азотсодержащие вещества. В качестве источника азота для питательной среды эффективно применять барду спиртовых заводов. Наилучшие выходы (1,6 у/мл) были получены при добавлении 4% барды к весу питательной среды. При этом максимальное образование витамина В₁₂ наблюдалось на четвертый день инкубации. Добавление к средам, содержащим барду, аминокислот, некоторых витаминов комплекса В, кукурузного экстракта, мочевины, пиримидинов, 5,6-диметил-бензимидазола не увеличивало выход витамина В₁₂.

S. olivaceus- быстро растет при 28—30⁰, при 41° роста нет. В каче­стве источника углеводов можно применять глюкозу, мальтозу, лакто­зу, крахмал и мелассу. На выход витамина В₁₂ влияет добавка кобаль­та в виде СоС1₂*6Н₂О, CoSO₄ *7Н₂0 и Со(NO₃)₂*6Н₂0. Максимальные выходы витамина B₁₂ были получены при добавлении 2,5 частей CoSО₄*7Н₂О на 1 млн. частей питательной среды. Схема производства относится к микроорганизму S. olivaceus. Исходную культуру выращивают на агаровой среде (косяки) при 28⁰С в течение 4—6 дней. Споры с косяков переносят в колбы, где при 28⁰С выращивают культуру 48 час. Затем ее переводят в инокулятор 1. Питательную среду готовят в смесителе 2, где ее сте­рилизуют при 120° в течение 60 мин. Состав питательной среды: барды 4%, глюкозы 0,5—1,0%. CaCO₃ —0,5% и CoCl₂*6H₂O — 1,5—10 част./млн.; рН доводят едким натром до 6,5—7,0. Из смесителя-стери­лизатора 2 среда поступает в ферментатор 3, где ее охлаждают водой до 22°. Из инокулятора 1 туда же вводят культуру и пускают струю воздуха давлением 2,5 атм. из компрессора 4 через измеритель возду­ха 5 и угольный фильтр 6, предварительно стерилизованный паром. Стерильный воздух пропускают в количестве 0,1—0,5 л в 1 мин. на 1 л среды. Ферментаторы имеют объем 20 м³, а инокуляторы — 1,4 м³. Раз­мер угольных фильтров: диаметр 0,45 м и высота 2,5 м. В инокуляторах культуру выращивают 2 дня, а в производствен­ных ферментаторах 3—4 дня. Признаком окончания процесса фермен­тации является разжижение среды. рН при этом повышается до 8,0 и более. Содержание витамина B₁₂ в культуральной жидкости в конце ферментации 1,0—2,0 у/мл. После окончания ферментации содержимое ферментатора перека­чивают в сборник 7, где витамин В₁₂ стабилизируют добавлением не­большого количества сульфата натрия и доведением рН серной кислотой до 5,0.

Культуральная жидкость содержит около 3% сухих веществ. Из сборника 7 ее направляют в вакуум-выпарной аппарат 8, где уваривают до сиропообразного состояния и спускают в сборник 9. Далее сироп поступает в атмосферную вальцовую сушилку 10, где высушивается до 5°/о влаги. Сухой продукт измельчают в дробилке11, откуда он поступает в смеситель 12, для расфасовки.

Производство кормового концентрата витамина В12: продуценты, среды, технологическая схема.

Methanosarcina barkeri, Metanobacterium formicum, Mtb. thermoautotrophicum.

Витаминный состав кормового концентрата, названного КМБ-12 (концентрат метанового брожения, содержащий витамин В₁₂), следующий, мг/кг натурального веса: В₁₂, пантотеновая кислота, рибофлавин, пиридоксин, никотиновая кислота, тиамин, фолиевая к., холин. Принципиальная схема производства кормового концентрата витамина В₁₂ (КМБ-12) из послеспиртовой и последрожжевой барды:

1) Метановое сбраживание

2) Обработка метановой бражки соляной кислотой

3) Подогрев и дегазация подкисленной метановой бражки

4) Упаривание метановой бражки

5) Сушка упаренной метановой бражки

6) Расфасовка и упаковка готового продукта (КМБ-12)

Концентрат содержит 25% протеинов. Образующиеся газы брожения (20-25 м3/т барды) содержат 65-70% метана, имеют теплотворную способность 6200-6500 ккал/м3 и используются как топливо. Конденсаты, получаемые при упаривании метановой бражки, после их охлаждения на градирне имеют БПК5 = 80-100 мг/л.

В России производство кормового препарата витамина B₁₂ основано в основном на переработке барды (отхода ацетоно-бутилового или спиртового производства) биоценозом бактерий, осуществляющих термофильное метановое брожение сточных вод.

Используют сложный консорциум анаэробных микроорганизмов, включающих углеводсбраживающие, аммонифицирующие, сульфатвосстанавливающие и метанобразующие бактерии.

Мезофильные и термофильные метаногенные бактерии, в том числе Metanobacterium thermoautotrophi-сит, Mb. thermoformicuin, Mb. bryantii, Metanosarcina barkeri, Ms. vacuolata, Ms. mazei, Methanococcus hatopilus, синтезируют исключительно фактор III.

Истинный витамин B₁₂ образуют неспорообразующие метилотрофы: Eubacterium limosum, близкий к нему Butyribacterium methylotrophicum и Acetobacter woodi. Путем создания искусственных биоценозов и подбора условий ферментации возможно целенаправленное регулированиепроцесса биосинтеза витамина В₁₂.[2]

По способу, разработанному УкрНИИСПом и внедренному на Андрушевском спиртовом заводе, последрожжевую барду используют для производства витамина В₁₂ . С этой целью барду сбраживают метанообразующими бактериями, бражку сгущают на выпарной установке и сушат на распылительной сушильной установке. Получаемый продукт является ценной витаминной добавкой в корма.

К барде добавляют метанол — до 2%, СоСl₂ -6Н₂О — 10 г/м³ , мочевину - 300 г/м³ и сухие кормовые дрожжи — 230 г/м³ . Добавление низших жирных кислот и низших спиртов позволяет значительно повысить выход целевого продукта. Дозировку обогатителей производят автоматически.

Барду подают в нижнюю часть ферментатора метантенка (на 4—5 тыс. м3 ), в котором автоматически регулируют параметры процесса, обеспечивая контроль температуры (55—57°С), рН (7,5—8,0) и длительности брожения. Одновременно в ферментер поступает посевной материал культуры микроорганизмов, предварительно выращенный в специальных аппаратах. Для выращивания продуцента требуются облигатно анаэробные условия. Для этого в среду подают диоксид углерода или газы, выделяющиеся в процессе ферментации. Процесс ведут непрерывно, ежесуточно заменяя 20—25% бродящей жидкости на свежую барду. В качестве пеногасителя используют рыбий жир.[2]

Для получения кормового препарата бражку выпаривают и сушат. Упаривание метановой бражки производится под вакуумом на четырехкорпусной выпарной станции, оборудованной аппаратами с естественной циркуляцией. Время работы ВУ между промывками 27-28 суток. Промывку осуществляют 2-3 %-ным раствором щелочи без механической чистки.

При метановом сбраживании последрожжевой барды бактерии используют не только органические соединения, но и некоторые кислотные радикалы солей. Сероредуцирующие бактерии переводят SO₄^2- в H₂S. В результате этих реакций катионы металлов Ca, K, Na связываются с образующимся при метановом брожении CO₂. Ввиду большого избытка CO₂ эти металлы образуют бикарбонаты. Растворимый бикарбонат кальция при упаривании превращается в нерастворимый CaCO₃:

Ca(HCO₃)₂ → ↓CaCO₃ + H₂O + CO₂

Во избежание образования отложений на поверхностях нагрева метановую бражку перед упариванием подкисляют соляной кислотой до рН 5,5-6,0 и, нагревая до температуры 100 гр. Цельсия, дегазируют. В этом случая нерастворимые соли кальция превращаются в хлористые легко растворимые соли:

CaCO₃ + 2 HCl = CaCl₂ + H₂O + CO₂

Поскольку витамин В₁₂ неустойчив при тепловой обработке, особенно в щелочной среде, его стабилизируют. Для этого получаемую в процессе брожения жидкость перед выпариванием подкисляют до рН 5,0—5,3 и добавляют к ней сульфит натрия (0,1—0,25%). Содержание витамина В₁₂ в исходной сброженной жидкости — 4,4 г/м3 . Сгущение сброженной барды осуществляют на выпарных аппаратах (до 14—17% содержания сухих веществ), а сушку в распылительной сушилке.

Концентрация витамина B₁₂ в высушенном препарате — 500—600 мг/кг. Истинный витамин составляет 20—25% от суммы корриноидов, фактор III — 35—40%, фактор В и другие — 40—45%. Получаемый препарат называют КМБ-12. [5]

Промышленное получение витамина B₁₂ – пример безотходной и экологически чистой технологии. Сырьем для ее реализации служат массовые отходы, а конечными продуктами – биогаз (65% метана, 30% диоксида углерода), использующийся как топливо, и биомасса метановых бактерий – источник биологически активных соединений, активирующих, например, ромт молочнокислых бактерий.[4]