4.3. Розподіл клітин і їх культивування [18]

Структуру органел і великі молекули можна вивчати під мікроскопом; для локалізації специфічних молекул в клітині розроблені ефективні методи фарбування. Проте, щоб розібратися в молекулярних основах клітинної організації, потрібний детальний біохімічний аналіз. На жаль, біохімічні методи припускають використання значної кількості клітин і в процесі дослідження клітини руйнуються. Якщо як зразок для біохімічного аналізу використовувати шматочок тканини, то після руйнування буде отримана суміш фрагментів різних клітин. І якщо тканина утворена клітинами різного гипа, що швидше є правилом, ніж виключенням, то розібратися в цій суміші буде просто неможливо. Намагаючись витягнути максимум інформації про усі клітини, що становлять тканини, клітинні біологи розробили методи розподілу тканин на клітини і методи виділення окремих типів клітин. Отриману відносно гомогенну популяцію клітин можна піддавати аналізу безпосередньо або заздалегідь розмноживши їх шляхом культивування.

4.3.1. Клітини можна виділити з тканин і розділити на різні типи [19]

Перший етап виділення клітин одного типу з тканини, що містить різні їх типи, полягає в перетворенні тканини на суспензію окремих клітин. Це досягається руйнуванням позаклітинного матриксу і міжклітинних контактів, що утримують клітини. Зазвичай найвищий вихід життєздатних клітин отримують з ембріональних гканей або гканей новонароджених. В цьому випадку процедура розподілу клітин включає обробку тканини протеолітичними ферментами (такими, як трипсин і коллагеназа) і з'єднаннями, зв'язуючими (чи хелатирующими) Са2+ (такими, як етилендиамінтетраоцетова кислота - ЭДТА), що визначають адгезію клітин. Потім, піддавши тканини м'якому механічному руйнуванню, їх розділяють на окремі клітини.

Для фракціонування змішаної суспензії клітин на окремі типи використовують декілька підходів Один з них заснований навідмінності. фізичних властивостях клітин. Наприклад, за допомогою центрифугування можна відокремити великі клітини від малих, а важкі від легенів; ці методи будуть розглянуті нами при обговоренні проблем фракціонування клітин (для чого власне ці методи і були розроблені). У основі іншого підходу лежить здатність деяких клітин міцно прикріплятися до скла або пластмаси, що дає можливість відділяти такі клітини від інших, що прикріпляються менш міцно.Важливе удосконалення цього методу має на увазі використання антитіл. Антитіла, що специфічно зв'язуються з клітинами одного типу (з тих, що є присутній в гкани), можна "пришити" до різних матриксів, наприклад колагену, полисахаридным кулькам або пластмасі. З такою поверхнею зв'язуватимуться лише клітини, пізнавані антитілами. Клітини, що зв'язалися, відділяють або за допомогою легкого струшування, або шляхом руйнування матриксу (наприклад, колагену) ферментами (наприклад, коллагеназой).Найбільш тонкий метод розподілу клітин включає мічення антитілами, пов'язаними з флуоресціюючими барвниками. З помошью електронного клітинного аналізатора (сортера), що флуоресцентний-активується, можна відокремити мічені клітини від немічених. Суть методу полягає в тому, що окремі клітини рухаються одна за одною у вузькому потоці і проходять через лазерний промінь, де виробляється оцінка наявності флуоресценції. Потім вібруюче сопло формує крихітні крапельки, більшість з яких містить тільки одну клітину або взагалі не містить клітин. У момент освіти крапля автоматично придбаває позитивний або негативний заряд залежно від наявності в ній флуоресціюючої клітини. Потім сильне електричне поле направляє краплі у відповідні контейнери. Випадкові грудки клітин пізнаються по посиленню светорассеяния, вони відкидаються в контейнер для відходів (мал. 4-38). Клітинний аналізатор здатний відібрати одну клітину з тисячі; кожну секунду він сортує близько 5000 клітин. Отримавши популяцію однакових клітин будь-яким з вищеперелічених методів, дослідник може використовувати їх для біохімічного аналізу. Існує і інша можливість: такі клітини можуть бути введені в культуру, що дозволяє вивчати їх поведінку і властивості в умовах культивування.

4.3.2. Основи култивування клітин.Клітини можна вирощувати в культуральній посудині [20]Більшість видів клітин рослин і тварин в сприятливих умовах здатні вижити, розмножитися і навіть диференціюватися. Використовуючи методи культури тканини, можна вивчати клітини під мікроскопом або аналізувати їх біохімічно. Крім того, додаючи в культуральну посудину і видаляючи з нього специфічні молекули, гакие, як гормони або чинники зростання, ми можемо судити про їх вплив на клітини. Застосування змішаних культур дозволяє вивчати взаємодію між різними типами клітин. У науковій літературі часто будь-які експерименти з клітинними культурами називають експериментами, виконаними in vitro, що дослівно означає "в склі"; навпаки, про експерименти на живих організмах прийнято говорити, що вони виконані in vivo. Декілька іншої сенс вкладається в ці терміни біохіміками і клітинними біологами. Для них in vitro відноситься до біохімічних реакцій, що відбуваються поза живими клітинами, a in vivo до усіх реакцій, які мають місце в живих клітинах. Народження методу культури тканин слід віднести до 1907 року. У той час був задуманий експеримент, який повинен був внести ясність в дискусію серед нейробіологів. Гіпотеза, правомочність якої слід було перевірити (що дістала назву "Нейронної доктрини"), зводилася до наступного: кожне нервове волокно утворюється, виростаючи з однієї нервової клітини, а не шляхом злиття багатьох клітин. Для підтвердження цієї гіпотези невеликі шматочки спинного мозку перешкодили в теплу вологу камеру і спостерігали під мікроскопом через рівні проміжки часу. Приблизно через добу можна було бачити що від окремих нервових клітин починають відходжувати довгі тонкі відростки. Так були отримані дані, що свідчили на користь нейронної доктрини, і був закладений фундамент для перевороту, що стався в результаті застосування методу клітинних культур.

Засадничі експерименти, проведені в 1907 році, включали використання невеликих фрагментів тканини або експлантатів. У наш час культури зазвичай готують з клітинної суспензії, отриманої шляхом дисоціації тканини Більшість клітин, що утворюють тканини багатоклітинних організмів, на відміну від бактерійних клітин не здатні рости в суспензії. Для зростання і ділення їм потрібна тверда поверхня. Спочатку, коли метод культивування тільки з'явився, як механічна опора використовували згусток плазми, але нині його зазвичай замінюють поверхнею пластикової культуральної чашки (мал. 4-39). Клітини дуже розрізняються по своїх потребах; деякі з них здатні рости або диференціюватися тільки у тому випадку, якщо культуральна чашка покрита компонентами позаклітинного матриксу. наприклад колагеном.

Культури, приготовані безпосередньо з тканин організму, з використанням первинного етапу фракціонування клітин і без оного, називають первинними культурами. В більшості випадків клітини первинної культури можна перенести з культуральної чашки і використовувати для отримання великої кількості вторинних культур, які можна послідовно перевивати протягом тижнів або місяців. Часто ці клітини зберігають ознаки диференціювання тих тканин, з яких вони були отримані. Так, фібробласти продовжують синтезувати колаген, клітини скелетних м'язів ембріона зливаються, утворюючи гігантські м'язові волокна, які спонтанно скорочуються в чашках для культури тканин; у нервових клітин виникають аксони, що характеризуються електрозбудливістю і здатністю формувати синапси з іншими нервовими клітинами; клітини епітелію формують великі шари, що зберігають багато властивостей інтактного епітелію. Оскільки усі ці події можна спостерігати при зростанні клітин в культурі, для їх вивчення використовують багато методів, недоступних при роботі з інтактними тканинами.