МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ

О.В. Карпов

БІОТЕХНОЛОГІЯ КУЛЬТУР РОСЛИН І ТВАРИН

конспект лекцій

для студентів спеціальності

7.092901 «Промислова біотехнологія» та

напряму 0929 "Біотехнологія"

денної та заочної форм навчання

СХВАЛЕНО

на засіданні кафедри

біотехнології мікробного синтезу

Протокол № 12

від 18.03.2008 р.

Київ НУХТ 2008

Культивування тваринних і рослинних клітин та тканин на даний час отримало широке розповсюдження в різних галузях досліджень, від клітинної та молекулярної біології, до біотехнології – у виробництві великої кількості імунобіологічних препаратів, включаючи різноманітні фактори крові людини, цитокіни, медичні та ветеринарні противірусні вакцини, а також моноклональні антитіла для різноманітних діагностичних наборів. Цей спосіб використовується при отриманні більшості фізіологічно-активних сполук – продуктів біосинтезу клітин. Застосування культур клітин також виявилося методом, що дозволяє вивчати багато морфологічних структур і спостерігати в умовах, найбільш близьких до природних, біохімічні та фізіологічні процеси, притаманні живим організмам. До того ж культури клітин використовуються в дослідах з виявлення токсичних властивостей хіміотерапевтичних препаратів, у тому числі антибіотиків тощо.

На жаль, зараз в Україні рівень розробок промислових систем культивування культур клітин значно поступається аналогічному рівню мікробіологічної промисловості. Внаслідок такого стану речей не виробляється чимало необхідних імунобіологічних препаратів як для лабораторного використання, так і для медичного та ветеринарного призначення; натомість більша частина імунобіологічних препаратів закупається за кордоном. Поряд з цим, у випадку культивування клітин людини та тварин, як і при вирощуванні мікроорганізмів, для розробки відповідних технологій та систем культивування може бути використана одна і та ж сума знань, зокрема щодо добре відомих інженерам-біотехнологам принципів масообміну. Проте для всебічного вивчення процесу культивування культур клітин доцільно проаналізувати історію становлення цієї галузі науки і виробництва, визначити пріоритетні напрямки розробки систем культивування та деякі “вузькі місця”, а також ознайомитися з позитивним досвідом закордонних виробників.

Культури клітин людини та тварин

Культивування клітин in vitro відомо з другої половини 19 століття і розвивалося на основі методів, прийнятих у тогочасній ембріології. У 1885 р. французькому дослідникові Ру вдалося на протязі не багатьох днів підтримати розвиток медуллярної платівки курячого ембріону в теплому сольовому розчині, що можна вважати першим зареєстрованим випадком успішної експлантації. Але це дослідження значно обігнало свій час, оскільки тоді ще не було можливості зберігати живими ізольовані тканини тварин. До 1898 р., коли Льюнгрен показав, що шкіра людини може переживати in vitro на протязі багатьох днів, якщо її вмістити у асцитичну рідину, для таких дослідів умови ще були не створені.

У 1903 р. Жоллі провів досліди, які були першими детальними спостереженнями над переживанням та поділом клітин in vitro. Цей вчений зберігав живими лейкоцити саламандри у висячій краплі біля місяця.

Однак вважається, що основи культивування клітин людини і тварин були закладені у 1949 році, коли американським вченим Ендерсу, Уеллеру та Робінсу вдалося виростити вірус поліомієліту у культивованих клітинах шкіри та м’язів зародку людини.

У 50-ті роки 20-го сторіччя у зв’язку з розвитком вірусології розвивались і методи культивування клітин тварин і людини, на основі яких створювалися нові вірусні вакцини. Так перший саме промисловий процес виробництва вакцини проти поліоміеліту із використанням клітин був здійснений у середині 50-х років. Він включав стадію культивування культури клітин нирки африканської зеленої мавпи (Vero), яка здійснювалася шляхом вирощування клітин на внутрішніх поверхнях флаконів чи роллерних посудин. Проте виробництво вакцини із залученням низькоефективних та працевитратних класичних методів культивування культур клітин було рентабельним лише у випадку вакцини проти поліоміеліту, в той час як потреби у об’ємах виробництва інших препаратів були значно більшими. Наприклад, імунізацію протиящурною вакциною потрібно проводити 2-3 рази на рік, а одна доза такої вакцини може містити 3 типи вірусу. Для приготування такої дози необхідно від 3 до 10 мл культуральної вірус-вмісної рідини. Отже, нагальним стало перевести виробництво вакцинних препаратів з класичних методів культивування культур клітин на нові та ефективні технології.

Тепер вже не являє великої проблеми виробництво у спеціальних ферментерах сотень і навіть тисяч літрів культуральної рідини, що містить вірус. Слід зауважити, що при виробництві інактивованих чи атенуйованих вірусних вакцин культура клітин є практично єдиним джерелом отримання вірусів. Завдяки застосуванню методу клітинних культур віруси почали виділяти у достатньо чистому вигляді, що у свою чергу сприяло швидкому прогресу діагностики вірусних захворювань і отриманню вакцин нових поколінь.

Культури клітин виявилися ефективними і для отримання різноманітних імунологічних препаратів. З розвитком методів генної інженерії стало можливим напрацьовувати окремі препарати білкової природи, використовуючи генетично змінені мікроорганізми. Однак і у цьому випадку застосування культур клітин виявилося більш доцільним, оскільки клітини тварин, на відміну від прокаріотичних клітин, здатні до здійснення посттрансляційної модифікації білків, і, таким чином, синтезувати білки людини, ідентичні природним. До того ж культури рослинних клітин є зручною моделлю для вивчення системи хазяїн - паразит (віруси, бактерії, гриби, нематоди, комахи), а також для пошуку важливих у господарстві метаболітів (токсинів, гербіцидів, регуляторів росту, тощо).

В ході досліджень виявилося можливим вирощувати віруси не тільки у клітинах первинних культур, тобто культур клітин, тільки що взятих від донора, але і у клітинах перещеплюваних ліній, тобто у клітинах, що підтримуються у культурі на протязі невизначено довгого часу. Існують лінії, що використовуються з цією метою у всьому світі. Прикладом таких ліній є клітини HeLa (карцинома шійки матки людини), ВНК-21 (нирка ембріонів хом’яка) та Vero (нирка зеленої мавпи).

Взята з організму первинна культура вважається такою до першого пересіву (пасажу), після чого вона стає клітинною лінією. Клітинна лінія початково може бути отримана з популяції клітин, а також з одиничної клітини. Якщо клітинна лінія походить від одиничної клітини, то її називають клоновою, або ж клоном.

Список типів клітин, які на даний час можна культивувати, є досить великим. Це елементи з’єднувальної тканини (фібробласти), скелетні тканини (кістка і хрящі), скелетні, серцеві та гладенькі м’язи, епітеліальні тканини (печінка, легені, молочна залоза, шкіра, сечовий міхур, нирки), клітини нервової системи (гліальні клітини та нейрони, хоча останні позбавлені здатності до проліферації), ендокринні клітини (наднирники, гіпофіз, клітини острівців Лангергансу), меланоцити та багато різних типів пухлинних клітин.

Клітинні лінії можуть мати обмежений строк життя in vitro (як наприклад диплоїдні фібробласти людини та тварин), а можуть розмножуватися in vitro необмежено довго. В останньому випадку лінії називають постійними. У вірусологічній практиці культивовані клітинні лінії прийнято називати “перещеплюваними”.

Деякі культури клітин можуть пасуватися багаторазово, тому вони стають доступними для роботи в багатьох лабораторіях світу, як це відбулося з культурою клітини HeLa. Такі культури часто називають штамами. В літературі терміни «лінія клітин» і «штам клітин» часто розглядаються як взаємозамінні.

Розвиток робіт на клітинних культурах, окрім вдосконалення методів, матеріалів та апаратури, був обумовлений отриманням постійних клітинних ліній. Відтворюваність і достатньо задовільна стандартність властивостей (характеристик) робить постійні клітинні лінії такими ж необхідними у роботі, як і чисті лінії лабораторних тварин. Крім відміченої стандартності, постійні клітинні лінії дали можливість отримання на їх основі нових мутантних ліній зі спрямованою зміною властивостей, необхідної дослідникам.

Всі постійні клітинні лінії, на відміну від культур нормальних клітин з обмеженим строком життя є трансформованими. Цей широкий термін має багато відтінків і у загальному вигляді лише віддзеркалює наявність деяких змін (трансформації) властивостей клітин. Виділяють різні ознаки (риси) трансформованості. Говорячи про трансформацію, завжди необхідно вказувати, за якими саме ознаками культура трансформована у порівнянні з нормальними клітинами. Можна вважати, що головним критерієм трансформованості є надбання "безсмертя". Такі культури вийшли з-під контролю організму і набули самостійності, тобто до деякої міри уподобилися до вільноживучих одноклітинних організмів. Слід підкреслити, що безсмертям володіє не окрема клітина, а культура (популяція), що зберігає від покоління до покоління певні властивості. Відмінності у властивостях нормальних і безсмертних клітин та більший період часу, що передує появі останніх (іноді декілька місяців), дозволяє припустити мутаційну природу їх появи (хромосомні перебудови, транслокації, часткове або повне неспарювання або точкові мутації). Неможливо також виключати і можливість передіснування безсмертних клітин, особливо в культурах, отриманих з пухлин.

Поява постійної лінії клітин констатується за морфологічними змінами (зменшенням розміру клітин, зниженням їх адгезивності, округленням та за збільшенням ядерно/цитоплазматичного співвідношення, за збільшенням швидкості росту (час подвоєння клітин в культурі знижується з 36-48 до 12-36 годин), по зниженню залежності від сироватки, по збільшенню ефективності клонування, по зниженню залежності від субстрату (здатність проліферувати зростає так же, як і формування клонів в агарі), по збільшенню гетероплоїдності (хромосомні відмінності між клітинами) і по збільшенню пухлинородності. Риси схожості між спонтанною трансформацією in vitro і злоякісною трансформацією очевидні, але тим не менш не можна вважати ці два процеси ідентичними. Нормальні клітини можуть трансформуватися у постійну лінію, не становлячись при цьому злоякісними; зі злоякісних пухлин можна отримати культури, які трансформуються і набувають вказаних вище ознак і при цьому стають більш, а іноді менш пухлинородними.

В процесі довгого культивування ті або інші властивості клітин змінюються, тому для підтримки постійності характеристик даної лінії звертаються до заморожування (зберігання у рідкому азоті) значної кількості клітин одного пасажу і наступного відновлення культури з цього запасу через певний проміжок часу. Слід також мати на увазі, що одні і ті ж лінії, що ведуться у різних лабораторіях, можуть відрізнятися за тими чи іншими параметрами.

Інші критерії трансформації, такі як змінена залежність від мікрооточення, від факторів середовища і онкогенність, проявляються у різних ліній в досить неоднаковій мірі. Тому розрізняють лінії мінімально трансформовані і сильно трансформовані, онкогенні та неонкогенні.

Всі постійні лінії отримані в результаті спонтанної або індукованої трансформації нормальних клітин in vitro або in vivo. Високою частотою спонтанної трансформації володіють клітини гризунів, особливо клітини миші. Наприклад, широко розповсюджені клітини ліній 3Т3 отримані завдяки спонтанній трансформації культивованих клітин ембріонів миші. Шляхом трансформації фібробластів шкіри миші in vitro отримана одна з перших постійних ліній – лінія мишачих L-клітин.

Лінія HeLa була отримана в результаті експлантації пухлини, яка виникла у людини, тобто в результаті злоякісної трансформації нормальних клітин в умовах in vivo. Багато постійних ліній мають в основі свого походження пухлини тварин, хоча експлантація пухлинних клітин in vitro не завжди веде до утворення клітинних ліній.

Найбільш легко культивуються і широко розповсюджені в лабораторній практиці лінії фібробластоподібних і епітеліоїдних клітин. До них відносяться мишачі клітини L, 3T3, клітини хом’ячкового походження BHK, CHO, V79, культури клітин людини: нормальних, наприклад WI-38, та трансформованих – Hep-2, KB, та інші лінії.

До переваг постійних ліній клітин відносяться їх більш висока швидкість росту, можливість досягнення більш високої щільності, і, таким чином, і більшого виходу біомаси, їх менша залежність від сироватки і можливість підтримання у більш простих середовищах, а також їх здатність до росту в суспензії. До недоліків цих ліній відносяться підвищена хромосомна нестабільність, відхилення від фенотипу донора та втрата специфічних тканинних маркерів.

Клітини більшості культур, включаючи первинні, розмножуються у формі моношару, прикріплених до скла або пластикового субстрату. Деякі культури, головним чином трансформовані клітини, кровотворні клітини та асцитні пухлини, можуть розмножуватися у суспензії. Цим забезпечується простота розмноження (субкультивування потребує лише розведення без трипсинизації), відсутність необхідності збільшення площі поверхні росту поряд зі збільшенням об’єму, простота збирання клітин та інш.

Для подальшого викладення матеріалу слід зупинитися на деяких, загалом вже відомих студентам відомостях з галузі цитології та гістології, але з урахуванням стану клітин в культурі.