Запобігання інфікування культур

Середовища, що використовуються для культур клітин і тканин, є досить поживними не тільки для клітин тварин, а і для бактерій та грибів. Більшість з цих мікроорганізмів мають більш швидкий ріст, ніж клітини, і часто утворюють токсини, що викликають загибель клітин. Тому найбільш важливою частиною техніки культивування клітин є виключення інфікування середовища і вирощування клітин в асептичних умовах.

Забрудненню мікробами можна запобігти стерилізацією і асептичною технікою. Стерилізація передбачає запобігання інфікуванню стерильних матеріалів. При роботі з культурою клітин можливі такі джерела інфікування: апарати, середовища, тканини, приміщення, у якому проводиться робота, персонал.

Апарати перед початком роботи для позбавлення від бактерій стерилізують. Середовище також звичайно стерилізується перед вживанням, але деякі компоненти готують в асептичних умовах. Тканини звичайно дістають в стерильних умовах з виконанням правил антисептики, але іноді виникає необхідність їх стерилізації. Потрапляння мікробів за рахунок інших джерел попереджують майже виключно шляхом дотримання правил асептики.

Стерилізацію можна вести:

1. Знищенням мікроорганізмів при дії на них сухого жару, пари та опромінення;

2. Знищенням мікроорганізмів за допомогою хімічної дії, наприклад антисептиками та антибіотиками;

3. Видаленням мікроорганізмів фізичними методами, наприклад фільтрацією, центрифугуванням та відмиванням.

Більшість апаратів стерилізують сухим жаром або парою. Як правило, апарати, які не пошкоджує дія високих температур, стерилізують сухим жаром, оскільки цей метод є найбільш придатним. Коли занадто висока температура сухого жару може пошкодити, використовують пару. Вона є більш ефективною, ніж сухий жар, оскільки висока температура, притаманна парі, швидко передається матеріалам, які стерилізують. Для стерилізації розчинів, гумових виробів, вати, тощо, часто застосовують автоклавування (стерилізація парою під тиском). Просте кип’ятіння використовується для обробки інструментів, і цей метод є достатньо надійним у більшості випадків. Іноді неможливо використовувати теплову стерилізацію, як, наприклад, для обробки деяких пластмас, що розм’якшуються при температурі біля 100⁰. У деяких випадках використовують антисептики, але вони повинні володіти відносною нешкідливістю і легкою летючістю. Частіш за все з цією метою використовують 70⁰ спирт. Ультрафіолетове опромінення можна використовувати для деяких предметів, наприклад підносів з пластмас.

Майже всі розчини можна фільтрувати, але деякі рідини, наприклад плазму і ембріональний екстракт не вдається добре профільтрувати, тому їх готують в асептичних умовах. Небагато розчинів простого складу, які не руйнуються при високій температурі, можна автоклавувати. Так як білки коагулюють при високій температурі, ця обробка не може бути використана для сироватки, ембріонального екстракту, плазми та інших середовищ біологічного походження. Однак при дотриманні деяких правил безпеки сольові розчини можна автоклавувати.

Розчини можна також стерилізувати за допомогою ультрафіолетового світла. Для цього необхідні спеціальні апарати; цей метод не знайшов широкого використання при культивуванні тканин. Антибіотики часто додають у поживне середовище , але їх не вносять разом з антисептиками. Антибіотики можуть бути використані у якості допоміжного нешкідливого засобу при випадковому забрудненні мікробами.

Для обробки лабораторних столів і стелажів використовують деякі антисептики. І у цьому випадку найбільш широко використовують спирт, яким протирають столи для зменшення числа бактерій, що на них знаходяться. Найбільш цінним методом стерилізації, таких поверхонь є осадження пилу, який інакше може підійматися у процесі роботи і осідати на різних предметах. З цією метою іноді змащують поверхню стола перед роботою вазеліновим мастилом, яке утворює злегка клейкий шар, що попереджує розпилення. Існує також практика змащувати з цією метою двері лабораторії мастилом через кожні декілька днів. Покриття столів можна також стерилізувати за допомогою ультрафіолетового опромінення, але і у цьому випадку потрібно пам’ятати про те, що стерилізуються лише ті поверхні, які знаходяться під прямою дією світла, а усі місця, що знаходяться в тіні, залишаються необробленими.

Стерилізація повітря може бути проведена багатьма шляхами. Як правило, немає необхідності стерилізувати повітря, оскільки інфікування за рахунок цього джерела може бути попереджене дотриманням звичайних правил асептики. Однак, якщо у наявності є джерело стерильного повітря, його краще за все отримувати через систему фільтрів, об’єднану з установкою для кондиціонування повітря. Повітря можна також стерилізувати за допомогою ламп ультрафіолетового світла, які включаються на певний час перед тим, як приміщення буде використане для роботи з культурою тканин. Слід дотримуватися обережності і не включати ультрафіолетові лампи під час роботи, так як це є шкідливим для очей персоналу. Повітря може бути також простерилізоване аерозолем, який осаджує пил та мікроорганізми. Для утворення аерозолю приміщення наповнюють парою. Роботу починають після того, як пара і разом з нею частки пилу осядуть. Такий спосіб збільшує накопичення вологи у приміщенні, що є небажаним, оскільки це сприяє росту плісняви і виживанню кліщів. Іншим джерелом утворення аерозолю може бути етиленгліколь, який розпилюється при підігріванні у посудині на плитці чи водяній бані.

За допомогою стерилізації сухим жаром можна стерилізувати майже увесь посуд. З циєю метою використовуються сушильні шафи з примусовою циркуляцією повітря. Однак можна використовувати будь-яку піч, у тому числі домашню кухонну плиту. Необхідно, щоб увесь вміст печі піддавався дії температури, що проявляє стерилізуючу дію. З циєю метою предмети у печі потрібно розподіляти таким чином, щоб повітря вільно циркулювало. Недоліком цього виду стерилізації є те, що сухе повітря – поганий провідник тепла, і тому всередині печі можуть залишатися “мертві точки” з відносно низькою температурою. Тому рекомендується проводити стерилізацію з достатньо високою температурою і продовжений час – звичайно на протязі 90 хвилин при 160⁰. Іноді мітять скло чутливою до температури фарбою, за зміною кольору якої можна точно знати, яка температура була досягнута при стерилізації. Запропонована велика кількість таких барвників, зокрема фарба “термоколор”.

Матеріал, який поміщують до печі, зручно стерилізувати у тонкостінних залізних контейнерах. Однак перед використанням для стерилізації залізних банок, зокрема від продуктів, їх слід розміщувати у піч у відкритому вигляді на 2-3 години. Це забезпечить видалення різних летючих матеріалів, що знаходяться у банках, інакше ж вони можуть осісти на посуді. Слід відмітити, що деякі банки вкриті зсередини лаком. Такі банки не підходять для стерилізації, оскільки лак згоряє у печі і випаровується, а продукти, що утворюються, осідають на посуді.

Скляні предмети перед стерилізацією можна загортати у фольгу або папір. З цією метою краще за все використовувати чистий обгортковий папір. При перегріванні папір стає крихким і може виділяти летючі смоли, які розподіляються на склі, тому при стерилізації слід дотримуватися обережності.

Стерилізація парою звичайно провадиться у автоклаві. Для обробки невеликої кількості посуду іноді зручніше використовувати домашню каструлю під тиском, яка побудована за тим же принципом, що і автоклав. Старий вертикальний тип автоклаву є менш зручним, ніж сучасна горизонтальна модель. Стерилізація у автоклаві може відбуватися при тиску 1/3, 2/3 або 1 атмосфера. Звичайно посуд рекомендується стерилізувати при 1 атм. на протязі 20 хвилин. Розчини стерилізують дещо менший час – як правило, на протязі 15 хв. При роботі зі старими типами автоклавів необхідно контролювати стерилізацію за часом та рівнем тиску, але краще вести контроль за температурою. В автоклавах нового типу це видно на термометрі, встановленому у місці виходу утвореної пари. Температура 115⁰ повинна підтримуватися на протязі біля 15 хвилин. Майже всі відомі мікроорганізми руйнуються в автоклаві за таких умов на протязі однієї хвилини, однак експозиція у 15-20 хвилин необхідна для того, щоб пара могла потрапити до всіх повітряних прошарувань між предметами, розміщеними в автоклаві. У випадку, коли пара недостатньо потрапляє до всіх камер автоклава, необхідно проводити другий контроль стерилізації. З цією метою використовують методи, що застосовуються у хірургії. Розміщуючи кольорові індикатори разом з матеріалами в автоклав, можна за зміною їх кольору судити про температуру при стерилізації.

При роботі з автоклавом необхідно, щоб усе повітря всередині нього було заміщене на пару, раніш, ніж почне збільшуватися тиск. У сучасних автоклавах це передбачене самою конструкцію; після того, як буде закрита кришка, необхідно дати вихід парі на протязі деякого часу.

При роботі з автоклавом слід брати до уваги ті ж міркування, які бралися до уваги при стерилізації сухим жаром. Особливо важливо, щоб предмети, які знаходяться у робочій камері автоклаву, були розміщені так, щоб пара їх вільно оточувала.

Перед автоклавуванням матеріали необхідно загорнути у папір або марлю. Великі посудини не можуть бути повністю загорненими, але всі отвори в них повинні бути закриті ватними корками, папером або алюмінієвою фольгою. Розчини слід стерилізувати у бутлях або флаконах, закритих ватно-марлевими корками. Посуд може бути також закритим гумовими корками або ковпаками, що загвинчуються, але у процесі автоклавування вони повинні нещільно закривати отвори, а щільно закриватися тільки після стерилізації. Краще використовувати ватно-марлеві корки, так як при остудженні розчинів повітря засмоктується всередину посудин і фільтрується крізь такі корки. При інших корках існує (правда невеликий) ризик потрапляння мікроорганізмів з повітря у середовище.

Для стерилізації може бути використаний інший вид вологого жару – кипляча вода. Лише дуже небагато мікроорганізмів виживає при кип’ятінні у воді на протязі декількох секунд, тому даний метод є особливо придатним для швидкої стерилізації.

Для стерилізації може також бути використане опромінення. Так, наприклад, ультрафіолетове опромінення використовується для стерилізації пластмасових посудин. Здійснюються спроби використання з цією метою гама-променів та нейтронів. Однак слід пам’ятати, що вказані фактори здатні викликати хімічні зміни в опромінених матеріалах. На даний час такі джерела опромінення мають досить обмежене застосування і головним чином використовуються ультрафіолетові промені для стерилізації боксів та кімнат, де проводяться роботи з таким патогенним матеріалом, як віруси.

Як відмічалося раніше, деякі антисептики використовуються для обробки лабораторних столів та стелажів. 70⁰ спирт є найбільш нешкідливим не тільки у силу своєї летючості, але і є відносно нетоксичним для культур клітин, принаймні у низьких концентраціях. З цією метою може бути також використаний ефір, але він не рекомендується, оскільки є речовиною відносно легкою і легко займаною. Іншою хімічною речовиною, що звичайно використовується для стерилізації, є хлороформ, який часто додають у якості консерванту до розчинів, наприклад до основних, що використовуються для складання збалансованих фізіологічних сольових розчинів. Хлороформ у процесі автоклавування випаровується.

Чашки з пластмас також можна стерилізувати спиртом. Для цього їх промивають у 95⁰ спирті, у вологому стані упаковують в паперові пакети і залишають в термостаті для висушування, після чого вони придатні для використання.

При роботі з культурами тканин застосовують багато антибіотиків. При роботі з культурою тканин не слід цілком покладатися на антибіотики, але, якщо іх не використовувати, працювати складніше. Слід відмітити, що багато антибіотиків є досить токсичними для клітин, і у деяких випадках величини токсичних концентрацій препарату наближаються до величин діючих доз.

Найбільш широко використовуваним антибіотиком для культур тканин є пеніцилін. Його зазвичай додають у вигляді натрієвої солі бензилпеніциліну для створення кінцевої концентрації від 20 до 50 ОД на 1 мл середовища. У таких концентраціях пеніцилін повністю нетоксичний для всіх типів клітин і разом з тим пригнічує ріст багатьох видів мікробів. У звичайній практиці рекомендується додавати у середовище тільки пеніцилін, однак при інфікуванні пеніцилін-стійкими мікробами корисне використання стрептоміцину, який додають із розрахунку 50 ОД на 1 мл середовища. Розвиток грибкової мікрофлори може бути попереджений мікостатином (ністатином). Цей фунгіцидний агент повинен вноситися із розрахунку 20 /мл. Слід відзначити, що мікостатин є нестабільним і звичайно майже повністю руйнується при інкубації більш 21 години при 37⁰. Крім того, продукти окислення цього антибіотика дещо токсичні. Вважається, що і стрептоміцин, і ністатин слід зберігати на випадок загрози зараження цінного штаму, так як іноді, використовуючи великі дози вказаних антибіотиків, вдається врятувати культуру від загибелі.

Крім звичайного використання антибіотиків у поживних середовищах, ці препарати можуть бути використані для стерилізації інфікованих тканин перед їх експлантацією.

Для здійснення стерилізації шляхом фільтрації використовуються різні види фільтрів, які можна розділити на чотири основні групи:

1. Азбестові прокладки;

2. Кізельгурові або фарфорові фільтри;

3. Скляні фільтри;

4. Мікропористі фільтри.

Асбестові прокладки типу Зейтца володіють тією перевагою, що надійно затримують всі мікроорганізми і дозволяють відносно високу швидкість фільтрації. Недоліком цих прокладок є те, що у деяких випадках вони вносять токсичні речовини які уподальшому можуть пригнічувати розвиток ростучих клітин. Більшість фільтрів, особливо попередньо промитих, вимогам відповідають. Але деякі їх види підходять для фільтрації середовищ, що використовуються для культивування тканин, лише після обробки дуже великими кількостями середовища, і якщо фільтри дуже ретельно промивають. Використовують багато типів апаратів для фільтрації. Фільтри з прокладками Зейтца особливо зручні для стерилізації сироватки.

Кізельгурові і фарфорові фільтри є, можливо, кращими фільтрами для стерилізації. Серед них розрізняють фільтри Селаса і фільтри Беркенфельда. Перед використанням нові фільтри слід попередньо підготувати, легко протираючи м’якою щіткою і добре промиваючи звичайною водопровідною водою у кількості декількох літрів в обох напрямках; далі необхідно фільтр промити 200 – 300 мл деіонізованої води. Фільтри цього типу можна стерилізувати автоклавуванням. Після використання їх теж промивають у обох напрямках дуже великою кількістю води. Якщо на фільтрах залишилися будь-які білкові речовини, їх можна видалити за допомогою розчину неочищеного трипсину або панкреатину. Коли фільтри забрудняться, їх можна очистити прокалюванням у муфельній печі. Температуру у печі слід повільно довести до 650⁰ на протязі 3-4 годин і на протязі ночі охолодити до нормальної. Перед розміщенням у муфельній печі, фільтри повинні бути ретельно висушені, інакше вони можуть дати тріщини у процесі прокалювання. Всі нові фільтри і фільтри, які були прокалені за даним методом повинні бути перевірені. Для цього кожний фільтр занурюють у воду і продувають крізь нього під тиском повітря. Під тиском, що використовується для фільтрації за звичайних умов, повітря не дифундує. При більш високому тиску спостерігається рівномірне виділення пухирців повітря на всій поверхні фільтру. Поява у деяких місцях нерівномірно збільшених пухирців повітря свідчить про тріщини.

Зернисті скляні фільтри використовуються для фільтрації невеликих об’ємів. Вони відрізняються тим недоліком, що фільтрація відбувається повільно. У цьому випадку також застосовують бактеріологічні типи фільтрів.

Мікропористі фільтри можуть використовуватися замість фільтрів Зейтца. Ці фільтри володіють тією перевагою, що не містять забруднень і дозволяють вести фільтрацію швидко. Використані фільтри викидають, тому немає необхідності у їх очистці. Однак на даний час ці фільтри досить дорогі.

При фільтруванні біологічних матеріалів більш бажано використовувати тиск, ніж вакуум. При використанні вакууму з розчинів вилучається окис вуглецю, і це призводить до значної зміни рН. Крім того, білкові розчини досить сильно піняться при використанні вакууму. Обидва ці небажані явища усуваються фільтрацією під тиском.

Інші фізичні методи вилучення бактерій, наприклад центрифугування і відмивання, є відносно неефективними, але у деяких випадках все ж використовуються. Сильно інфіковані мікробами рідини можуть освітлюватися перед фільтруванням шляхом центрифугування. Ретельне промивання матеріалів дистильованою водою або стерильним фізіологічним розчином сприяє видаленню мікробів, якщо вони не повністю адсорбовані або зв’язані з матеріалом, що обробляється. Інфіковані культури тканин можуть бути очищені таким чином, і культури завжди слід промивати, раніш ніж ліквідувати мікробне зараження додаванням антибіотиків.