Проліферація у масовій культурі

Життєздатність розморожених клітин, як залежних від субстрату, так і тих, що ростуть у суспензіях, оцінюють також за їх проліферацією на протязі перших 1-2 тижнів після розморожування. Для цього:

1. Суспензію клітин (5% всієї партії заморожених ампул) розсіюють з різною щільністю в однакові культуральні сосуди. При цьому в одні сосуди садять стільки клітин, щоб через сім діб культура досягла повного моношару або максимальної щільності. У інші флакони – вдвічі більшу кількість клітин, а у треті – у 3-5 разів більше клітин, ніж у перші (у залежності від кількості життєздатних клітин).

2. Через 4 діб змінюють середовище (або додають свіжого середовища, якщо клітини ростуть у суспензії).

3. Збирають клітини з усіх трьох наборів культур стандартною трипсинизацією, якщо клітини прикріплені до субстрату, або відбирають певну частину суспензійної культури і підраховують кількість клітин за допомогою гемоцитометра або електронного лічильника клітин.

4. Визначають ступінь збільшення кількості клітин (відношення числа отриманих клітин до числа посіяних) та порівнюють отримані результати з теоретично розрахованими результатами для клітин на логарифмічній фазі росту.

Визначення якості клітинних ліній

Окрім оцінки виходу клітин після заморожування рідким азотом необхідною є перевірка клітин і за іншими параметрами, включаючи підтвердження виду і доказ відсутності забруднення грибами, бактеріями і мікоплазмою. Тип клітин, від якого бере початок лінія, може бути підтверджений рядом імунологічних тестів, аналізом ізоферментного складу та/або цитогенетичними методами.

Культури тканин та клітин вищих рослин

Окремо слід зупинитися на питанні культури тканин та клітин вищих рослин. Важливі для медицини та сільського господарства технології in vitro розроблені з використанням об’єктів різної складності організації, починаючи з ізольованих протопластів і закінчуючи ізольованими зав’язями та зародками.

Практична реалізація біотехнології культур клітин рослин є досить широкою. Зараз вирощують не лише клітинну біомасу як джерело біологічно активних речовин, а й отримують рослини з поліпшеними якісними ознаками (збалансованим вмістом жирів, незамінних амінокислот, зміненим вмістом вуглеводів, покращеним зберіганням), стійкістю проти біотичних та абіотичних стресових факторів навколишнього середовища (хвороб, шкідників, вірусів, віроїдів, бактеріозів, засолення, закислення ґрунтів, гербіцидів), а також рослини з підвищеним синтезом біологічно активних речовин. Масштабність практичного застосування культури клітин рослин обумовлена тим, що рослинній клітині притаманна тотипотентність – властивість клітин диференційованих клітин рослини після їх дедиференціації відновлювати частину або весь організм і давати початок рослині-регенеранту. Соматичні клітини рослин є тотипотентними і тому від клітин, ізольованих з різних тканин рослини, можна регенерувати цілу рослину.

В культурі рослинних клітин in vitro, що виникла з будь-якої спеціалізованої тканини, відбуваються всі форми морфогенезу, притаманні вищім рослинам: утворення коренів, стебел, квіток, зародків.

Створення культур клітин вищих рослин стало можливим після того, як були розроблені відповідні середовища і режими культивування.

Як і у випадку культур клітин людини та тварин, в результаті введення клітин вищих рослин в умови in vitro утворюється нова біологічна система. Її особливістю є те, що в ній структурні елементи цілісного організму – клітини, які звичайно виконують лише строго визначені функції, стають незалежними організмами, здатними до автономного розвитку. Культивовані клітини вищих рослин є унікальною клоновою популяцією, що не має прямих аналогів у природі, але розвивається і еволюціонує за загальнобіологічними правилами і законами.

Основним типом культивованої рослинної клітини є калюсна. Відомо, що у культурі тканин певного виду рослин в результаті поділу диференційованих клітин утворюються недиференційовані вакуолізовані клітини, що ростуть хаотично, утворюючи клітинну масу - так званий калюс (у перекладі з латині це слово означає мозоль). Ця тканина утворюється не тільки в пробірці, але і в природних умовах. У природі для рослини калюс є тканиною, що виникає у виняткових обставинах (звичайно при травмах). Ця тканина захищає місце поранення, накопичує поживні речовини для регенерації анатомічних структур або втрачених органів. Саме на калюсні перетворюються спеціалізовані і меристемні клітини рослин після їх перенесення в умови на штучні живильні середовища. На калюсні клітини перетворюються не лише пошкоджені тканини, а й зовсім непошкоджені (клітини пилку, пилкової трубки).

Для одержання культивованих калюсних клітин фрагменти тканин різних органів вищіх рослин (експланти) вміщують на штучне живильне середовище в пробірки, колби, чашки Петрі. Процес одержання первинного калюсу і підтримання субкультивованої культури потребують дотримання умов асептики. Для цього за допомогою різних стерилізуючих розчинів, що містять найчастіше активний хлор (гіпохлориди) з доданими для поліпшення змочування детергентами, стерилізують експланти.

Первинний калюс, утворений на експлантах, через 3-8 тижнів (залежно від темпів росту) переносять на свіже живильне середовище. Техніка культивування тканин рослин нині дає змогу одержати тривалу пересадну калюсну культуру з будь-яких живих клітин інтактної рослини. По-різному диференційовані клітини переходять in vitro до складного процесу дедиференціації, втрачаючи властиву їм структурну організацію, специфічні функції, та індукуються до поділу, утворюючи первинний калюс. У процесі культивування утворюються клітинні штами, які характеризуються індивідуальними генетичними і фізіологічними властивостями.

Культура калюсних тканин вирощується поверхневим способом або на напівтвердому агаризованому середовищі (концентрація агар-агару 0,5-1,0%), на середовищі із застосуванням інших полімерів, що можуть утворювати гель, або на містках з фільтрувального паперу чи дисках з пінополіуретану, напівзанурених у рідке живильне середовище. Основні компоненти живильних середовищ для культури тканин і клітин рослин – мінеральні солі (макро- і мікроелементи), джерело вуглецевого живлення – звичайно сахароза або глюкоза, вітаміни, регулятори росту. Іноді до складу живильних середовищ включають комплексні органічні добавки. Це можуть бути гомогенати кокосових горіхів, кінського каштана, кукурудзи та інших злаків, а також березовий сік, екстракти з органів вегетуючої рослини, томатний сік, солодовий екстракт, дріжджовий екстракт, гідролізат казеїну, суміш амінокислот, екстракти з різних органів рослини. При цьому клітини калюсу досить помітно змінюють співвідношення ферментних та структурних білків, які вони синтезують.

Як правило, починаючи працювати з новим об’єктом, дослідники модифікують склад стандартних середовищ, особливо часто змінюючи концентрацію і набір органічних елементів. Оптимізацію складу середовища з багатьох компонентів проводять зараз із застосуванням методів математичного планування експерименту.

Визначальним моментом перетворення будь-якої клітини рослини на калюсну є дія гормонів – регуляторів росту (ауксинів та цитокінінів) у таких концентраціях та співвідношеннях, які в організмі, як у єдиній системі, на цю клітину не діяли. Можна стверджувати універсальність перетворення на калюсні всіх типів клітин, ізольованих із рослини та культивованих у відповідних умовах. Після декількох пересадок калюс може пристосуватися до росту без фітогормонів, які починають синтезувати його власні клітини, утворюючи за певних умов цілу рослину.

Регенерації повноцінних рослин з калюсу досягають в принципі двома шляхами: диференціацією пагонів та коренів шляхом зміни співвідношення гормонів ауксину та цитокініну, або ж утворенням так званих ембріоїдів.

Якщо до поживного середовища додати гормони в певних співвідношеннях, в культурах калюсу можна індукувати ріст паростків та кореневої системи. Ауксини стимулюють ріст коренів, цитокініни - утворення конусу росту та паростків. Щоб утворювалися і корені, і паростки, ауксини та цитокініни повинні бути взяті в певних співвідношеннях. Якщо відношення ауксинів до цитокінінів високе - утворюються корені, якщо низьке - паростки.

Під назвою ауксини об’єднано цілу низку речовин - регуляторів росту. Найважливіші з них отримали найменування гетероауксину і являють собою бета-індоліл-оцтову кислоту, або ж ІУК. ІУК у великих кількостях утворюється мікроорганізмами, дріжджами та деякими грибами. У даний час хіміками синтезована ціла низка ауксинів, серед яких особливо великою активністю володіє бета-нафтил-оцтова кислота.

Близько до групи гетероауксинів стоять гербіциди, які являють собою похідні феноксі-оцтової кислоти. В культурі клітин, тканин та органів рослин частіш за все застосовують 2,4-дихлорфенокси-оцтову кислоту (2,4-Д), 2,4,6-трихлорфенокси-оцтову кислоту та 2-метил-4-хлорфенокси-оцтову кислоту. Володіють активністю і використовуються як вільні кислоти, так і розчинні у воді натрієві та амонійні солі цих кислот, а також їх ефіри. Крім того, застосовуються етаноламінові солі. Ці гербіциди були відкриті на початку другої світової війни одночасно у США та Великобританії.

2,4-Д може замінити гетероауксин в культурі тканин, причому він більш ніж у 10 разів активніше за останнього викликає утворення коренів, розклад крохмалю, підсилює дихання. Дуже слабкі концентрації гербіциду діють стимулююче на проростання сім’ян та на розвиток мікроорганізмів.

Прискорений ріст рослин, і зокрема з клітин калюсу, відбувається під дією продуктів обміну речовин гриба Gibberelia fujukuroi. Ці речовини (терпеноїди), виділені у чистому вигляді, отримали назву гіббереллінів.

Гібберелліни здатні стимулювати не тільки ріст рослин, але і їх цвітіння. Їх застосовують головним чином для прискорення проростання ячміню при виготовленні солоду та для підвищення врожайності винограду.

Пізніш була відкрита низка сполук, що проявляють сильну стимулюючу дію на поділ рослинних клітин. Це вже згадані вище цитокініни. З них найбільш активним виявився кінетин. Дуже активною сполукою виявилася також дифенилсечовина, виділена з кокосового молока.

Для виявлення ефекту дії ростових речовин необхідні надзвичайно малі їх концентрації. Так одного граму ауксину вистачить для 10¹³ рослин. Для наглядності, якщо розсадити таку кількість рослин, надавши кожному площу харчування в 1 см², знадобиться площа більш ніж 900 кв. км.

Активність ростових речовин рослин на одиницю маси за активністю не поступається активності тваринних гормонів.

До активних речовин, що відіграють суттєву роль в культурі тканин, належать також вітаміни. Так тіамін (анейрин, вітамін В1) приймає участь у процесі росту коренів. Багатократні пасажі клітин кінцівок коренів без нього неможливі. Необхідними є також никотинова кислота та вітамін В6.

Інший шлях утворення рослин з клітин калюсу – утворення ембріоїдів, був вперше простежений у 1959 р. у моркви; з часом його стали застосовувати при виробництві життєздатних рослин різних видів.

Цікаво, що, як показано дослідниками, клітини калюсу здатні в лабораторних умовах до своєрідного “загартовування”. Так, якщо клітини без “загартовування” ледве переносять температуру -20⁰С, то з загартовуванням вони здатні витримати і -35⁰С, а деякі з них (клітини сибірської яблуні) витримують і -50⁰С. Зараз з’явилась можливість відбору клітин з великою морозостійкістю з калюсу пшениці та ялини.

Ізольовані клітини зберігають здатність синтезувати речовини, притаманні батьківській рослині - вітаміни, гормони, алкалоїди, кумарини, стероїди і т.д. Це має велике значення з точки зору утилізації таких речовин для промисловості.

У 1949 році було встановлено, що тканина апікальної меристеми рослин практично не містить вірусів. Отримані від таких меристемних культур рослини також не містять вірусів. Зараз меристемні культури широко застосовують для створення незаражених вірусом культур картоплі, інших сільськогосподарських рослин, а також квітів.

Меристемні культури використовують для вегетативного розмноження рослин. Метод використовується тоді, мають місце труднощі у статевому розмноженні сорту, або коли отримано вдалий гібрид, але його властивості неможливо зберегти, розмножуючи статевим шляхом, або ж для розмноження соматичних мутантів - так званих спортів. Для розмноження дерев використовують клітини молодих листів з верхівки дерева без пошкодження меристеми верхньої бруньки (в іншому випадку дерево неодмінно загине).

Метод культур тканин або мікророзмноження in vitro є виключно зручним для швидкого розмноження і зберігання здорових рослин. Для цього здійснюють відбір відповідних рослин і піддають їх стерилізації з наступним переносом на придатне живильне середовище. При цьому кількість відібраних рослин - експлантів залежить від виду і фази розвитку рослини, органу, з якого взятий експлант, сезону року. Встановлено, що меристемні тканини, серцевина цибулин та кореневищ надійно захищені листям та лусочками, є стерильними. Перед видаленням покривних структур їх кожний раз протирають 70% етанолом. Відкриті органи – джерела експлантів піддають стерилізації за допомогою ртуть- або хлормістячих агентів.

Подальше культивування рослинних культур здійснюють з застосуванням спеціальних мікропористих поліпропіленових мембран, оброблених спеціальною поверхнево-активною речовиною для покращення проходження живильних речовин. Ця методика суттєво прискорює ріст у порівнянні з класичним агаризованим середовищем, краще вдається звільняти культури від інгібуючого впливу фенольних речовин, що виділяються в середовище, а також зберігати клітинну лінію від суттєвих пошкоджень при вивченні метаболітів, що продукуються культурами. Таким чином вдається зменшити кількість матеріалів, і як наслідок, знизити вартість, оскільки культури можуть підтримуватися на протязі довгого часу без заміни культуральних контейнерів.

Зміни, що спостерігаються в ізольованій культурі, можуть виникати внаслідок мутацій специфічних генів і хромосомних перебудов. При цьому частота, тип та стабільність мінливості залежить від генотипу вихідної рослини та фізіолого-біохімічного стану клітини. Вважається, що самі по собі умови ізольованої культури приводять до глибокої клітинної дестабілізації. Широкий спектр варіантів, що утворюються з матеріалу, який культивується, є віддзеркаленням дестабілізації, за чим слідує дія відбору та вторинні спадкові зміни в популяції клітин.

Ця мінливість, що спостерігається, має велике значення при застосуванні культури клітин та тканин для покращання сільськогосподарських культур.

Вплив мутагенами (хімічними речовинами, або радіацією) збільшує частоту змінених клітин, а використання селективних умов (наприклад, використання підвищеного інфекційного фону) створює передумови для розмноження тільки змінених в заданому напрямку клітин. Однак сучасною тенденцією в цій галузі є відмова від використання мутагенів для того, щоб не отримати додаткових небажаних мутацій, тим більш, що мутантних клітинних ліній виникає досить і без втручання мутагенів.

Значно рідше культивують клітини пухлин рослин різного походження. Такі клітини мало відрізняються зовнішньо і на рівні морфології від культур калюсних клітин. Значним фізіологічним розходженням між ними є гормональна незалежність пухлинних клітин, що дає їм змогу ділитися і рости на живильних середовищах без додавання гормонів – регуляторів росту.

Клітини рослин можна культивувати також і у рідких поживних середовищах. Вирощування клітин у рідкому поживному середовищі дає змогу впливати на метаболізм і ріст популяцій за допомогою екзогенних факторів, а також проводити різні експерименти. Культури клітин рослин, що вирощуються на рідкому поживному середовищі, звичайно називають суспензійними, або глибинними. Термін «суспензійні» у даному випадку не є строго науковим і точним, тому що не пояснює основних особливостей поводження клітин під час такого вирощування. Окремі клітини, невеличкі групи або досить значні агрегати (понад 50 клітин) вирощують у стані завису в рідкому середовищі. При цьому застосовують різні апарати і способи підтримання клітин у такому стані.

Початковий етап одержання суспензійної клітинної культури є подією до деякої міри випадковою. Це означає, що тільки клітини, які з багатьох причин здатні до перебудови метаболізму і діляться з високою інтенсивністю у цих конкретних умовах культивування, здатні до утворення у подальшому стабільних клітинних ліній. Оптимальні характеристики подібних клітин такі: високий ступінь дезінтеграції (до 5-10 клітин у групі), морфологічна гомогенність клітин (невеликі розміри, сферична або злегка овальна форма, щільна цитоплазма) та їх висока життєздатність, інтенсивні ріст і розмноження.

Звичайно клітинні суспензії одержують так: калюсну тканину переносять у колбу з рідким живильним середовищем, потім колбу вміщують на качалку або на спеціальні пристрої, де суспензія перемішується за допомогою роллерів та шейкерів різного типу.

Ініціація суспензійної культури потребує 2-3 г свіжої маси калюсної тканини на 60-100 мл рідкого живильного середовища. Швидкість перемішування для одержання первинної суспензії на круговій качалці – 100-120, а на качалці з поступально-зворотнім рухом – 60-80 об/хв.

Клітини експланту мають утворити первинний калюс і тільки після цього поверхневі калюсні клітини, що потрапили в рідке середовище і розмножилися в ньому, дадуть початок лінії, спроможній рости в суспензії. При цьому пухкі, обводнені культури калюсних тканин придатніші для перенесення в суспензію, ніж структуровані, щільні калюси. Вирощування калюсів на середовищі з 2,4-дихлорфеноксиоцтовою кислотою , зменшення в середовищі іонів кальцію, обробка пектиназою транспланта, призначеного для вирощування в суспензійній культурі, збільшують шанси на успішне подальше культивування.

Первинну суспензію перед субкультивуванням фільтрують крізь 1-2 прошарки марлі, нейлонові або металеві сита, щоб позбутися щільних шматків калюсної тканини (або залишків експланта) і великих агрегатів. Фільтрування рекомендується і у кількох наступних субкультивуваннях до набуття клітинною суспензією бажаних характеристик. Проте агрегованість суспензії залежить не тільки від характеристик початкової лінії, а і від умов культивування.

Чисті культури рослинних клітин, отримані у такий спосіб, можуть бути використані в біосинтетичних та біотрансформуючих реакціях для одержання бажаного цільового продукту.