Міністерство освіти і науки, молоді та спорту України

Національний університет харчових технологій

Сумський технікум харчової промисловості

«Затверджую»

Директор технікуму

___________ Барилюк Ю.А.

«___» _____________ 20 р.

Інструктивно-методичні матеріали

до лабораторних занять з біохімії

спеціальності 5.05170104 «Виробництво хліба, кондитерських,

макаронних виробів і харчоконцентратів»

Розглянуто і схвалено

на засіданні циклової комісії

дисциплін математичної та

природничо-наукової підготовки

протокол № від _______

Голова ________ Яценко С.Г.

Інструкційна картка до проведення лабораторного заняття № 1

1.Тема заняття «Властивості білків.Осадження білків».

2.Мета проведення заняття: навчитись лабораторним шляхом здійснювати осадження білків різними способами

2.1.Після виконання роботи студент повинен

знати фізико-хімічні властивості білків, основні методи осадження білків;

уміти проводити якісне визначення в розчині білків; здійснювати хімічні реакції, що покладені в основу осадження білків.

3. Матеріально-технічне оснащення робочого місця: обладнання: нагрівальний пристрій, воронки, фільтрувальний папір, пробіркотримачі, штативи з пробірками; мірні пальчики;

реактиви: розчин яєчного білка, 10% -й розчин гідроксиду натрію, 10 % -й розчин купрум (ІІ) сульфату, концентрована нітратна кислота, концентрована хлоридна кислота, концентрована сульфатна кислота; 1% - ний та 10% -ний розчин оцтової кислоти, насичений розчин натрій хлориду, кристалічний натрій хлорид; насичений розчин амоній сульфату, кристалічний амоній сульфат, 10 % -й розчин три- хлороцтової кислоти; 20%-ний розчин сульфосаліцилової кислоти, 0,5 %-й розчин плюмбум ацетату, 3%-й розчин аргентум нітрату; етиловий спирт; дистильована вода;

4. Інструктаж з техніки безпеки : інструкція №1, 2, 4, 7.

5. Короткі відомості з теоретичної частини роботи

Принцип методу: висолювання – це оборотне осадження білків із розчинів під дією солей лужних металів (амоній сульфату, натрій хлориду, натрій сульфату). Солі пригнічують дисоціацію карбоксильних груп та аміногруп залишків амінокислот, які входять до складу білків. Це сприяє переходу білка в ізоелектричний стан та втраті гідратної оболонки. Після видалення нейтральної солі діалізом або у разі зниження концентрації солей білок знову розчиняється у воді або буферному розчині. Цей метод широко використовується для розділення білкових сумішей та добування білків у чистому стані завдяки тому, що різні білки мають неоднакову розчинність у розчинах нейтральних солей. Так, глобуліни випадають в осад вже при напівнасиченні розчинів сульфатом амонію (50 %-е насичення), а альбуміни випадають в осад тільки при повному (80-100%- ному) насиченні.

6. Зміст і послідовність виконання

Дослід 1. Розділення альбумінів і глобулінів сульфатом амонію

У пробірку налийте 2-3 мл розчину білка, прилийте рівний об’єм насиченого розчину (NH₄)₂SO₄ і перемішайте. При цьому осаджуються глобуліни (50% насичення). Через 5 хв осад відфільтруйте; фільтрат, що містить альбуміни, зберіть. До фільтрату додайте сухий сульфат амонію до насичення і спостерігайте осадження альбумінів. Осад альбумінів відфільтруйте. З фільтратом проробіть біуретову реакцію, щоб упевнитись у відсутності білка. Для порівняння проробіть біуретову реакцію з вихідним розчином білка.

Дослід 2. Висолювання солями важких металів

Принцип методу: солі важких металів – Hg, Pb, Cu, Ag, Zn осад-жують білки в результаті утворення нерозчинних у воді комплексних сполук із сульфгідрильними групами білків. Таке осадження є необоротним. Деякі солі важких металів, взяті у надлишку (солі купруму, плюмбуму, цинку), розчиняють утворений ними осад білків Це явище , що називається адсорбційною пептизацією , зумовлено адсорбцією йонів важких металів на поверхні білків і появою завдяки цьому позитивного заряду внаслідок чого білки переходять в розчин.

У три пробірки налийте по 4-5 краплин 1 %- го розчину яєчного білка і додайте по краплині розчини : в першу пробірку – 5 % -го розчину CuSO₄ в другу – 0,5 % -го розчину (CH₃COO)₂Pb, в третю – 3 %- го розчину AgNO₃. Перевірте розчинність осадів у надлишку солей, у воді.

Спостереження: Висновок:

Дослід 3. Осадження білків органічними розчинниками

Принцип методу: органічні розчинники дегідратують білкові молекули й тим самим знижують їх стійкість в розчині. Осадження білків органічними розчинниками (спирт, ацетон та ін.) при короткочасній дії оборотне, тобто, якщо одержаний осад швидко відокремити від розчинника, то білок зберігає свої природні властивості і може бути знову розчинений у воді. Осадження проходить тільки із нейтральних і слабкокислих розчинів і особливо повно в присутності електроліту (NaCl), бо йони солі зв’язуються колоїдними частинками білка і знімають заряд. При довгому стоянні зі спиртом білок денатурує й стає нерозчинним у воді.

У пробірку налийте 1 мл розчину білка, додайте трохи кристалічного NaCl і після цього поступово прилийте 2-3 мл етанолу і інтенсивно перемішайте вміст пробірки.

Спостереження: Висновок:

Швидко відділіть осад від розчинника і додайте води.

Дослід 4. Осадження білків концентрованими мінеральними кислотами

Принцип методу: концентровані мінеральні кислоти (крім ортофосфатної) осаджують білки внаслідок денатурації і дегідратації білкових молекул. У надлишку всі мінеральні кислоти (крім нітратної) розчиняють утворений осад, що пов’язане з перезарядженням білкових молекул і частковим їх гідролізом , нітрування ж заважає даному процесу.

Налийте (обережно!) у три пробірки по 0,5 мл концентрованих кислот – нітратної, сульфатної, хлоридної . Нахиливши кожну пробірку, обережно прилийте по стінці приблизно по 0,5 мл білка так, щоб рідини утворили два шари. На межі двох рідин з’являється білий аморфний осад білка. Перевірте розчинність осаду у надлишку кислот.

Дослід 5. Осадження білків органічними кислотами

Принцип методу: деякі органічні кислоти осаджують білки в результаті денатурації та дегідратації білкових молекул, а також у результаті утворення комплексних солей білків з кислотами.

ТХО осаджує тільки білки і не осаджує проміжні продукти розпаду білків та амінокислоти. Сульфосаліцилова кислота осаджує не лише білки, а і високомолекулярні пептони і поліпептиди. Реакції осадження білків органічними кислотами набули широкого практичного значення.

У 2 пробірки налийте по 1 мл розчину білка, прилийте у першу 3-4 краплини 10%-ного розчину трихлороцтової кислоти, у другу – 3-4 краплини 20%-ного розчину сульфосаліцилової кислоти. Перевірте розчинність осадів у воді.

Дослід 6. Осадження білків при кип’ятінні

Принцип методу: стійкість білків у розчині зумовлена наявністю гідратної оболонки і певного заряду молекули білка. Порушення факторів, що стабілізують структуру молекули білка, призводить до осадження білків. Так, при кип’ятінні більшості білків порушуються зв’язки, властиві нативному стану молекули білка.

Кращий спосіб осадження білків - кип’ятіння у середовищах, що мають значення рН, яке дорівнює ізоелектричній точці білків. Внесення в розчин білка нейтральних солей (сульфату амонію, хлориду натрію тощо) полегшує і прискорює осадження під час кип’ятіння в результаті дегідратування білкових часток

У сильнокислих і сильнолужних розчинах білок не випадає в осад, оскільки у кислому середовищі він завжди має позитивний заряд, у лужному – негативний.

У п’ять пробірок налийте по 2 мл 1% розчину яєчного білка. Першу пробірку нагріти до кипіння. У другій пробірці розчин білка нагріти до кипіння і добавити 5 крапель 1% розчину оцтової кислоти.

У третю пробірку добавити 1 мл 10 % - го розчину оцтової кислоти для утворення сильнокислого середовища, нагріти до кипіння.

У четверту пробірку налити 0,5 мл 10 %- го розчину оцтової кислоти і декілька краплин насиченого розчину кухонної солі і нагріти.

У п’яту пробірку добавити 0,5 мл 10 % -го розчину гідроксиду натрію, створюючи лужне середовище, нагріти до кипіння.

7. Методичні рекомендації з виконання та оформлення роботи

Після кожного досліду необхідно відзначити спостереження та зробити висновок. Після останнього досліду результати випадіння осаду чи утворення розчину занесіть до таблиці, за формою, наведеною нижче та зробіть висновок.

Нейтральне середовище	Слабкокисле середовище	Кисле середовище	Кисле сере- довище + електроліт	Лужне

8.Рекомендована література

1.Кучеренко М.Є. та ін Біохімія. – К.: ВПЦ «Київський університет»2002. с.103- 105

2. Боєчко Ф.Ф. Біологічна хімія. – К.:Вища школа,1995, с.134-140.

3.Кретович В.Л. Биохимия растений. – М.: Высшая школа.1985.

4. Салюк А.І. Практикум для студентів технологічних спеціальностей денної форми навчання. – К.: НУХТ.2008, с.34-41