Інструкційна картка до проведення лабораторного заняття № 2

1.Тема заняття «Кількісне визначення білка на основі біуретової реакції».

2. Мета проведення заняття: засвоїти метод визначення білка за біуретовою реакцією

2.1.Після виконання роботи студент повинен

знати основні методи якісного та кількісного визначення білків; методику визначення білка за біуретовою реакцією;

уміти проводити кількісне визначення білка на основі біуретової реакції

3. Матеріально-технічне оснащення робочого місця: обладнання: фотоелектроколориметр; мірні колби на 25,00 мл.

реактиви: біуретовий реактив (1,5 г сульфату міді, 6 г сегнетової солі, 300 мл 10 % - го розчину гідроксиду натрію розчиняють у 1 л дистильованої води); 1, 2, 3, 4, 5 % - ні розчини яєчного білка; дослідний розчин білка;

4. Інструктаж з техніки безпеки : інструкція №1, 2, 4, 5.

5. Короткі відомості з теоретичної частини роботи.

Принцип методу грунтується на побудові калібрувального графіка і визначення за ним вмісту білка у виданому розчині.

Серед колориметричних методів, що грунтуються на кольорових реакціях на білки, розповсюдження набув метод кількісного визначення білка за допомогою біуретового реактиву ( розчину купрум (ІІ) сульфату і сегнетової солі у NaOH певної концентрації).

У лужному середовищі у присутності солей купруму (ІІ) розчини білків набувають фіолетового забарвлення, зумовленого наявністю у молекулі білка пептидних зв’язків, що утворюють за даних умов солеподібні комплекси.

Інтенсивність забарвлення комплексу залежить від кількості пептидних зв’язків, а отже, від кількості білка у розчині та від кількості солі купруму (ІІ) Якщо додавати визначену кількість солі купруму (ІІ), то ступінь забарвлення буде прямо пропорційний концентрації білка у розчині.

6. Зміст і послідовність виконання

Для отримання стандартних розчинів білка приготуйте вихідний розчин певної концентрації, наприклад 5 %-ний. Заповніть цим розчином бюретку. В 5 пронумерованих мірних колб на 25 мл налийте розчин згідно таблиці з бюретки, тобто в першу колбу - 1 мл; в другу 2 мл і т.д. Після цього в кожну колбу додайте відповідну кількість дистильованої води (за таблицею). У шосту колбу - 10 мл дистильованої води. Потім прилийте до вмісту кожної колби біуретовий реактив до мітки, закрийте колбу пробкою і ретельно перемішайте.

№ колби	1	2	3	4	5	6
V 5% розчину білка ,мл	1	2	3	4	5	0
V води, мл	9	8	7	6	5	10
W розчину білка,%	1	2	3	4	5	0

Через 30 хвилин на фотоелектроколориметрі визначте оптичну густину (екстинкцію) при червоному світлофільтрі. Як контроль використовуйте пробу з дистильованою водою.

Результати перших п’яти проб використовуйте для побудови калібрувального графіка. На осі абцис відкладіть значення концентрації стандартних розчинів білка, на осі ординат – відповідні їм значення оптичної густини. Одержані точки з’єднайте прямою лінією.

Одержіть певний об’єм дослідного розчину білка з дистильованою водою, переведіть його в біуретовий комплекс, доведіть біуретовим реактивом об’єм колби до мітки й перемішайте .

7. Методичні рекомендації з виконання та оформлення роботи : побудуйте калібрувальний графік залежності оптичної густини від концентрації розчину білка. Визначивши значення оптичної густини дослідного розчину білка, за калібрувальним графіком знайдіть його концентрацію, зробіть висновок.

8.Рекомендована література

1.Кучеренко М.Є. та ін Біохімія. – К.: ВПЦ «Київський університет»2002. с.103- 105

2. Боєчко Ф.Ф. Біологічна хімія. – К.:Вища школа,1995, с.134-140.

3.Кретович В.Л. Биохимия растений. – М.: Высшая школа.1985.

4. Салюк А.І. Практикум для студентів технологічних спеціальностей денної форми навчання. – К.: НУХТ.2008, с.41-42