Культивирование вирусов в культуре клеток .
По числу жизнеспособных генераций культуры клеток подразделяются на:
первичные, способные размножаться только на первых генерациях, т.е. в нескольких пассажах после выделения из тканей;
Диплоидные клеточные штаммы, полуперевиваемые, имеющие ограниченную продолжительность жизни (40 - 100 пассажей).
Клеточные линии, перевиваемые, или стабильные, способные размножаться в лабораторных условиях неопределенно длительный срок посредством постоянного пассирования;
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчение ткани, разъединение клеток путем трипсинизации, отмывание полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующем суспендированием клеток в питательной среде.
Этапы получения первичной культуры.
Берут ткань молодого животного (лучше всего эмбриона).
Кусочки ткани отмывают от эритроцитов в растворе Хенкса.
Кусочки ткани заливают теплым раствором трипсина на растворе Хэнкса.
Раствор ставят на магнитную мешалку, в колбу кладут магнит.
Проводят дробную трипсинизацию.
Раствор трипсина сливают в центрифужные пробирки. В растворе находятся отдельные клетки.
Центрифугация в течении 10 минут - 1000 об/мин, затем трипсин сливают.
Клетки помещают в питательную среду:
Культивирование вирусов в культуре клеток .
Клетки, полученные из различных органов и тканей человека, животных, птиц или других биологических объектов, способны размножаться вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде (`матрасы', флаконы, пробирки и др.).
Большое распространение получили культуры клеток из эмбриональных и злокачественно перерожденных тканей, обладающих более активной по сравнению с нормальными клетками взрослого организма способностью к росту и размножению.
Диплоидные клеточные штаммы – это клеточные линии, в которых до 75% клеток имеет кариотип нормальных клеток исходного типа и способные сохранять исходный диплоидный набор хромосом в течение 40 - 100 пассажей. В процессе пассирования культуры клеток, часть клеток может терять один тип хромосом и приобретать другой, то есть кариотип этих диплоидных клеток отличается от исходного. При этом некоторые возможности вирусного генома реализуются лишь в клетках с исходным кариотипом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека широко используются в диагностической вирусологии и при производстве вакцин.
Популяция, в которой менее 75% клеток с исходным диплоидным набором – это линия гетероплоидных клеток.
Перевиваемые клеточные линии, перевиваемые однослойные культуры клеток приготавливают из злокачественных или нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa , первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Hep - 3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, CV-1, почек обезьян, BHK-21 хомячка, и др. Это трансформированные клетки, трансформация которых вызвана экспрессией в норме не используемого, или нового введенного извне генетического материала. При этом источник нового генного материала должен быть известен. Перевиваемые клеточные линии, как правило, теряют большинство свойств исходных клеток, и по их морфологическим и биохимическим показателям часто невозможно определить их происхождение.