2.6 Изучению микрофлоры донных осадков на лицензионном участке предполагаемой нефтедобычи компании «Приазовнефть»

В качестве объектов исследования были использованы пробы донных осадков из мест предполагаемого бурения в акватории Азовского моря. Пробы осадков помещали в полиэтиленовые контейнеры и транспортировали к месту проведения анализа. Во избежание роста морских водорослей и возбуждения естественной микробиологической активности пробы хранили в темноте. Анализ осуществляли в микробиологической лаборатории ВятГУ г. Кирова. Следует отметить, что при бактериологических исследованиях не предусмотрено консервирование и хранение проб. В нашем случае пробы доставлялись в лабораторию в течение нескольких суток. Разумеется, при таких условиях в пробах происходят микробиологические изменения, характер которых не поддается прогнозированию. Ввиду того, что почва для обитающих в ней микроорганизмов является субстратом, возможно и наиболее вероятно их спонтанное развитие, которое приводит к нарушению межвидовых микробных взаимоотношений. Вместе с тем оценка микрофлоры проб и характер распределения в них разных групп микроорганизмов, при последующих равных условиях отбора, могут быть вполне объективными.

Первоначально, при получении образцов проб почвы необходимо провести их оценку. Традиционное описание почв с целью их агрохимического состояния и плодородия в настоящее время часто дополняют оценкой их экологического состояния с целью:

идентификации техногенного загрязнения почвы;

оценки ухудшения качества почвы из-за ее загрязнения;

прогнозирования поведения загрязняющих веществ;

оценки последствий интенсивного землепользования [71, 72, 73].

Международный стандарт ИСО 11259 устанавливает описание почв и экологическое состояние окружающей среды на основании требований ФАО. Согласно данному стандарту, при описании почв приводится: общая характеристика, метеорологические условия, геоморфологические данные, природа воды, внешний вид поверхности, общие типы почв и другие характеристики. Ввиду того, что анализ образцов почв в момент их отбора в полевых условиях не проводился, нами из стандарта были выбраны характеристики, предположительно влияющие на содержащуюся в ней микрофлору. Ими оказались: текстура, структура, наличие примесей и крупных элементов, влажность, содержание органического материала, наличие газовыделения, уплотняемость, пористость.

Результаты исследований показали, что большинство образцов по таким показателям, как влажность, наличие газовыделения, структура, текстура, пористость не имели отличий. Пробы были насыщены влагой, на ощупь липкие, илисто-мыльные, песчаные частицы совсем или почти не ощутимы, основная часть материала мелкодисперсная непористая, структура непрерывная, органического материала мало, либо отсутствует, газовыделения не обнаружено. Другая часть проб содержала в значительном количестве примеси в виде крупных включений ракушечника, за счет чего их оценка имела несколько отличный характер (таблица 7).

Таблица 7 - Характеристика проб грунта

Код (идентификатор)	Наличие включений	Наличие крупных элементов	Уплотняемость
G2-1	Обильно	Много	Немного уплотненный
G2-2	Обильно	Доминирующие	Уплотненный
G2-3	Обильно	Много	Немного уплотненный
G2-4	Немного	Нет	Свободная
G2-5	Много	Много	Немного уплотненный
G2-6	Обильно	Доминирующие	Уплотненный
G2-7	Некоторые	Некоторые	Свободная
G2-8	Обильно	Доминирующее	Уплотненный
G2-9	Обильно	Доминирующее	Немного уплотненная
G2-10	Обильно	Доминирующее	Очень плотный
G2-11	Много	Много	Немного уплотненный
G2-12	Отсутствуют	Нет	Свободная
G2-13	Обильно	Много	Уплотненный
G2-14	Немного	Немного	Свободная
G2-15	Некоторые	Некоторые	Свободная
G2-16	Отсутствуют	Нет	Свободная
G2-17	Некоторые	Некоторые	Свободная
G2-18	Много	Много	Немного уплотненный
G2-19	Много	Много	Немного уплотненный
G2-20	Отсутствуют	Нет	Свободная
G2-21	Некоторые	Некоторые	Свободная
G2-22	Некоторые	Некоторые	Свободная
G2-23	Отсутствуют	Нет	Свободная
G2-24	Несколько	Несколько	Немного уплотненный
G3-10	Отсутствуют	Нет	Свободная

Следующим этапом настоящих исследований являлось определение общего количества сапрофитных микроорганизмов в пробах грунта.

Бактерии выделяли из проб чашечным методом на ПС на основе перевара Хоттингера с добавлением 1% NaCl. Пробы разводили дистиллированной водой десятикратным разведением и соответствующее разведение в количестве 0,1 мл высевали на ППС в чашках Петри, которые инкубировали в термостате при температуре (27- 29)С и просматривали каждые 24 часа. По окончанию инкубирования выбирали чашке Петри с единичными колониями, проводили их количественный учет. Результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8 – Общее микробное число в образцах морской воды, отобранных со станций II уровня производственно-экологического контроля ООО «НК «Приазовнефть» из акватории Азовского моря ( Х±I₉₅, n=4)

Код (идентификатор)	Количество сапрофитных бактерий в пробах грунта (тыс ж.м.к.см^-3), отобранных в… 2006 г.
	июле	октябре
G 2-1	211±15	4±1,1
G 2-2	106±9	2,4±0,3
G 2-3	28±7	1,2±0,1
G 2-4	27±4	1,3±0,2
G 2-5	31±3	1,6±0,4
G 2-6	50±9	3,2±1,3
G 2-7	225±24	27±3,0
G 2-8	55±7	4±1,2
G 2-9	89±10	9±2,4
G 2-10	14±2	0,15±0,03
G 2-11	177±24	19±2,4
G 2-12	55±9	3,4±0,6
G 2-13	17±2	0,12±0,02
G 2-14	8±2	0,10±0,05
G 2-15	35±7	1,7±0,3
G 2-16	34±8	1,4±0,1
G 2-17	209±20	29±4
G 2-18	22±5	1,2±0,3
G 2-19	56±11	3,8±1,7
G 2-20	12±6	0,73±0,09
G 2-21	31±5	1,5±0,4
G 2-22	65±12	6,4±1,9
G 2-23	7±2	0,09±0,01
G 2-24	18±4	0,23±0,04
G3-10	32±3	1,6±0,5

Результаты исследований, представленные в таблице, отражают общее количество сапрофитных микроорганизмов в отобранных пробах грунта. Снижение содержания микроорганизмов в осенний период можно объяснить тем, что пробы грунта представлены в основном мезофильными бактериями, температурный оптимум роста которых находится в пределах от 10 до 45-50 ^оС. Сезонное понижение температуры окружающей среды замедляет метаболические процессы в данных микробных сообществах, тем самым уменьшая количество жизнеспособных микроорганизмов в грунте. Наличие функционально доминирующих психрофильных видов микроорганизмов в субстрате – грунте для данной климатической зоны не является установленным фактом.

Проведенные исследования сравнительной оценки проб грунта по общему количеству сапрофитных микроорганизмов в летнее и осеннее времяна года показывают, что климатический фактор районов, проектируемых для разведочного бурения, является значимым показателем, а значит должен учитываться при проведении данного вида работ.

Одновременно с определением общего количество сапрофитных микроорганизмов изучали морфологические особенности их колоний и клеток методом световой микроскопии. Ввиду того, что по морфологическим признакам выросшие на ППС колонии из разных проб грунта распределялись на поверхности ППС в чашках Петри приблизительно одинаково, для анализа были отобраны несколько различающихся по внешнему виду изолированных колоний (таблица 9).

Таблица 9 - Морфологические особенности колоний и клеток бактерий

№ п/п	Морфология колоний бактерий	Микроскопия окрашенных по Граму мазков
1	Округлые, блестящие, желто-белые, гладкие, выпуклые, с волнистым краем, диаметр 3-4 мм	Отдельно расположенные мелкие грамотрицательные палочки с прямыми концами
2	Округлые, матовые, ярко-желтые, гладкие, выпуклые, с ровным краем, диаметр 1-2 мм	Грамположительные кокки, расположенные гроздями

Продолжение таблицы 9.

3	Округлые, матовые, белые, с волнистым краем, ослизненные, диаметр 2-3 мм	Отдельные короткие грамотрицательные палочки
4	Округлые, матовые, бело-желтые, гладкие, выпуклые, с ровным краем, диаметр 2-2,5 мм	Грамотрицательные мелкие единичные палочки
5	Округлые, блестящие, желто-белые, выпуклые, с ровными краями, диаметр 2-3 мм	Грамположительные палочки формы
6	Неправильной формы, бугристые лимонно-желтые; диаметр 3-3,5 мм	Отдельные чуть изогнутые грамотрицательные палочки
7	Округлые, светло-коричневые, шероховатые, с неровными краями диаметр 3-4 мм	Тонкие удлиненные грамотрицательные палочки с полярными включениями
8	Рост в виде субстратного мицелия, частично врастающего в агар	Сплетения гифов, грамположительные
Примечания: 1. В тесте Хью-Лейфсона все исследования бактерий давали отрицательную реакцию: цвет среды не менялся, оставаясь бутылочно-зеленым. Контрольный штамм E.coli 803 окислял и ферментировал глюкозу: цвет среды менялся с бутылочно-зеленого на желтый.

На основе анализа морфологических признаков колоний и клеток и руководствуясь определителем Берджи, проводили идентификацию отдельных микроорганизмов до рода [69]. В пробах грунта оказались представители бактерий рода Pseudomonas, Marinococcus, Arthrobacter, Alcaligenes, Vibrio, Agrobacterium, Micromonospora.

Следующим этапом настоящей работы являлись исследования по определению численности микроорганизмов различных физиологических групп (амилолитические, липолитические, фенолокисляющие и углеводородокисляющие). Опыты проводилось по методу предельных разведений на среде Ворошиловой-Диановой с последующей статистической обработкой по методу Мак-Креди [66]. Результаты представлены в таблицах 10, 11.

Таблица 10 - Вероятное содержание физиологических групп микроорганизмов (амилолитические, липолитические, фенолокисляющие, углеводородокисляющие и ксилолокисляющих) в пробах грунта акватории Азовского моря

Код станции	Количество микроорганизмов физиологических групп … (тыс м.к.см^-3) в пробах грунта, отобранных в июле 2006 г.
	амилолитические	липолитические	фенолокисляющие	углеводородокисляющие	ксилолокисляющие
G 2-1	170	35	3,5	28	4,0
G 2-2	140	10	1,0	10	1,3
G 2-3	40	4	0,5	3	0,5
G 2-4	9	5	0,8	3	0,6
G 2-5	15	1,2	0,2	1,1	0,1
G 2-6	40	7	0,5	7	0,5
G 2-7	35	3	0,2	3	0,2
G 2-8	55	1,3	0,2	1,1	0,1
G 2-9	90	15	1,4	15	1,3
G 2-10	11	1,6	0,2	1,4	0,1
G 2-11	130	25	1,5	25	1,7
G 2-12	60	9,5	1,0	10,2	1,0
G 2-13	10	0,7	0,2	0,7	0,1
G 3-10	0,5	0,2	0,1	0,1	-
G 2-15	45	5	0,7	5	0,6
G 2-16	118	15	3,5	15	3,7
G 2-17	210	45	6,0	45	5,0
G 2-18	17	2,5	1,2	3,0	1,1
G 2-19	85	8,5	0,7	8,5	0,7
G 2-20	30	5	0,1	5	0,1
G 2-21	35	3	0,1	2	0,1
G 2-22	60	5	0,1	5	0,1
G 2-23	2	0,7	0,1	0,7	0,1
G 2-24	5	1,3	0,1	1,4	0,1

Таблица 11 - Вероятное содержание физиологических групп микроорганизмов (амилолитические, липолитические, фенолокисляющие, углеводородокисляющие и ксилолокисляющих) в пробах грунта акватории Азовского моря

Код станции	Количество микроорганизмов физиологических групп … (тыс м.к.см^-3) в пробах грунта, отобранных в июле 2006 г.
	амилолитические	липолитические	фенолокисляющие	углеводородокисляющие	ксилолокисляющие
G 2-1	5,0	0,7	-	0,6	-
G 2-2	3,0	0,2	-	0,2	-
G 2-3	1,7	0,1	-	0,1	-
G 2-4	0,3	-	-	-	-
G 2-5	1,5	0,1	-	0,1	-
G 2-6	4,0	0,3	-	0,3	-
G 2-7	0,6	0,1	-	0,1	-
G 2-8	1,8	0,1	-	0,2	-
G 2-9	9,5	1,7	-	2,7	-
G 2-10	0,1	-	-	-	-
G 2-11	7,4	0,1	-	0,1	-
G 2-12	4,3	0,4	-	0,4	-
G 2-13	0,1	-	-	-	-
G 3-10	-	-	-	-	-
G 2-15	1,0	0,1	-	0,1	-
G 2-16	13,7	1,8	-	1,8	-
G 2-17	14,8	0,2	-	0,2	-
G 2-18	1,5	0,1	-	0,1	-
G 2-19	1,5	0,1	-	0,1	-
G 2-20	3,0	0,1	-	0,1	-
G 2-21	1,4	0,1	-	0,1	-
G 2-22	6,8	0,2	-	0,2	-
G 2-23	1,0	-	-	-	-
G 2-24	1,0	-	-	-	-

Полученные результаты свидетельствуют, что субстратная специфичность микроорганизмов грунта была неоднородной. Наибольшее число микроорганизмов регистрировалось в амилолитической группе (0,5 – 170 тыс м.к.см^-3), что, по-видимому, связано с наличием в грунте отмерших остатков одноклеточных водорослей, являющихся для них основным элементом субстратного питания. Численность физиологических групп микроорганизмов (липолитические, фенолокисляющие, углеводородокисляющие и ксилолокисляющие) в пробах грунта, отобранных из мест предполагаемой нефтедобычи в июле месяце составило в пределах 0,1 – 35,0 тыс м.к.см^-3. Указанное обстоятельство позволяет надеяться на то, что на момент отбора проб донные отложения практически не содержат веществ, загрязняющих данную экологическую нишу и косвенно свидетельствует о нормальной экологической ситуации.

Анализ проб грунта в октябре месяце показал наличие фоновых количеств аналогичных групп микроорганизмов, характеризующихся специализированными ферментными системами, что связано с сезонным уменьшением их метаболической активности.

ОБОБЩЕНИЕ И ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

В настоящее время проблема защиты окружающей среды от антропогенного воздействия входит в число приоритетных направлений, поскольку с развитием и интенсификацией хозяйственной и промышленной деятельности человека объем вредного воздействия на природу стал превышать ее восстановительный потенциал. Не является исключением и акватория Азовского моря. На его берегах располагаются агропромышленные комплексы, целый ряд населенных пунктов, активно ведется нефте-газоразведка, добыча и транспортировка углеводородного сырья. Все это создает предпосылки для попадания в море нефти и нефтепродуктов, оказывающих влияние на состояние ее водной экосистемы. Загрязнение водоема нефтью и нефтепродуктами непременно приводит к нарушению биологического равновесия, изменению физических, физико-химических свойств воды, токсическому действию на гидробионты и т.д. В то же время постоянно происходит и параллельно процесс трансформации загрязняющих веществ, приводящий к стабилизации условий в водоеме и восстановлению биоценоза. Главная роль в этом многостадийном процессе биотрансформации физико-химических форм загрязнений нефти до простых соединений и их дальнейшем включением в общий круговорот углерода принадлежит микроорганизмам. Одна из самых многочисленных групп микроорганизмов, участвующих в процессе самоочищения водоемов от загрязнений, является сапрофитная, состав которой варьирует в зависимости от содержания в воде органических веществ. В то же время, многими исследователями признана причастной к самоочищению водоемов углеводородокисляющая группа гетеротрофных микроорганизмов, способных к окислению нефтяных углеводородов. Изучение динамики изменения численности УВОМ в природных экосистемах позволяет оценивать степень загрязнения водных экосистем нефтью.

Целью исследований являлся микробиологический мониторинг акватории Азовского моря и его прибрежной зоны по экологически значимым показателям для оценки состояния природно-антропогенного комплекса. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие за­дачи:

- оценить качество морской воды по микробиологическим показателям;

- изучить микробное разнообразие почвы прибрежной зоны Азовского моря.

Первый этап исследований заключался в изучении культурально-морфологических свойств бактерий с использованием ПС на основе перевара Хоттингера с добавлением 3% NaCl. Результаты исследований показали, что микробные культуры в пробах морской воды в 70% случаев представлены грамотрицательными палочками. Проведенная в последующем идентификация выделенных 14 культур с использованием ряда биохимических тестов, НЕФЕРМ-теста 24 фирмы PLIVA-Lachema, а также теста для выявления цитохромоксидазы с использованием диагностической полоски ОКСИ-тест, показала различную таксономическую принадлежность выделенных бактериальных культур из проб морской воды (таблица 3). Выделенные и идентифицированные культуры широко распространены в окружающей среде, некоторые из них могут быть патогенными для человека, животных и растений. Свойства бактерий также разнятся (таблица 2). Об этом свидетельствует и тот факт, что при высеве культуры бактерий на агар Хоттингера с добавлением генцианвиолета в соотношении 1:10000 на поверхности агаровых пластин не формируются колонии бактерий K. zopfii (порядковый номер № 11), P. alcaligenes и A. faecalis type 2 (порядковые номера 15 и 16).

Следующим этапом исследований явилось определение фонового состояния воды по общему числу микроорганизмов в 1 мл в поверхностных водах Азовского моря, взятых в местах предполагаемого бурения.

Бактерии выделяли из проб морской воды чашечным методом на ППС на основе перевара Хоттингера с добавлением 3% NaCl. Чашки Петри с посевами образцов воды инкубировали в термостате при температуре (27- 29)С и просматривали каждые 24 часа (таблица 4). Исследования показали достоверные различия в показателе общего числа микробов в пробах воды, взятых в летне-осенний периоды. Однако указанные значения можно считать фоновыми для соответствующего периода, поскольку на скорость размножения микробов, продукцию фитопланктоном органического вещества в значительной степени влияет температура окружающей среды.

Определение численности физиологических групп микроорганизмов (амилолитических, липолитических, фенолокисляющих и углеводородокисляющих) проводили методом предельных разведений на среде Ворошиловой-Диановой с последующей статистической обработкой по методу Мак-Креди [54] (таблицы 5, 6). Полученные результаты свидетельствуют, что изменения численности физиологических групп микроорганизмов (липолитические, фенолокисляющие, углеводородокисляющие и ксилолокисляющие) в пробах морской воды, отобранных из мест предполагаемой нефтедобычи в июле и октябре месяце, связаны также с сезонными изменениями температуры окружающей среды. Так, наибольшее число микроорганизмов регистрировалось в амилолитической группе (0,9 – 250 тыс м.к.см^-3) в пробах, отобранных в июле месяце, что, по-видимому, обусловлено избытком легко доступных органических веществ водорослей прибрежных и открытых районов моря. В то же время, в пробах воды, отобранных в октябре месяце, наблюдалось снижение численности во всех вышеуказанных группах микробов.

Дальнейшие исследования были направлены на установление динамики интенсивности процесса самоочищения морской воды в местах предполагаемого бурения по количественному содержанию сапрофитов, вырастающих при температурах 20С в течение 48 ч и 37С в течение 24 ч.

Соотношение численности этих групп микроорганизмов позволило судить о динамике интенсивности процесса самоочищения морской воды (рис. 3, 4). Результаты исследований показали, что в июле месяце у половины исследуемых проб морской воды число сапрофитов выросших при температуре (20-22)С, преобладает над числом сапрофитных микроорганизмов, выросших при температуре 37 С, что указывает на равновесное состояние между самоочищением и загрязнением воды. В октябре месяце в 90% проб морской воды, взятых из мест предполагаемого бурения нефти, процесс самоочищения преобладал над процессом загрязнения. Данный факт можно объяснить тем, что эвтрофикация Азовского моря в летний период, вероятно, вызвана собственной продукцией органических веществ, а не посторонним внесением загрязнений.

Результаты исследований, представленные в таблицах 10, 11 отражают общее количество аэробных микроорганизмов в отобранных пробах и их выраженное морфологическое разнообразие. Снижение содержания микроорганизмов в осенний период можно объяснить тем, что микрофлора донных осадков и морской воды представлена в основном мезофильными формами, остро реагирующими на понижение температуры ниже ее придельного значения. Барьерное значение температуры морской воды в осенний период (10-15 ^оС) не позволяет в должной мере развиться психрофильным микроорганизмам. Поэтому полученные результаты микробиологических исследований в осенний период можно считать фоновыми.