2.1.4 Биологические аспекты самоочищения водоемов

Самоочищение - это процесс трансформации загрязняющих веществ, сопряженный с процессом восстановления биоценоза. В результате биотических взаимодействий происходит биотрансформация физико-химических форм загрязнений и их разрушение в процессе биохимического окисления. Для различных природных зон длительность отдельных стадий этих процессов различна, что связано в основном с водно-почвенно-климатическими условиями. Микробное окисление углеводородов - один из ведущих факторов процесса элиминации нефти [36].

Одна из самых многочисленных групп микроорганизмов, участвующих в процессе самоочищения водоемов от загрязнений, является сапрофитная (от греч. sapro — гнилой, phyton — растение) – это микроорганизмы, питающиеся готовыми органическими веществами, т. е. относящиеся к гетеротрофным организмам. К сапрофитным микробам относится большинство дрожжей, плесеней и значительная часть бактерий [3].

Количество сапрофитных микроорганизмов в воде варьирует в весьма широких пределах — от единиц до миллионов в 1 мл, в зависимости от вида водоисточника и, особенно, от степени его загрязнения. Открытые водоемы более богаты сапрофитными микробами по сравнению с подземными водоисточниками. Количество микроорганизмов в подземных водоисточниках во многом зависит от глубины залегания водоносного слоя и его защищенности от попадания загрязнений. Как правило, чем поверхностнее расположены грунтовые воды, тем больше в них содержится микробов. В водах глубоких и хорошо защищенных водоносных горизонтов содержатся лишь единичные микроорганизмы, а иногда они могут совсем отсутствовать.

Прибрежная зона водоемов содержит большее количество сапрофитов, чем отдаленная от берега, что связано с вымыванием микрофлоры из почвы и с попаданием в водоем поверхностного стока. В озерах, водохранилищах и морях со значительными глубинами наибольшее количество сапрофитов обнаруживается в поверхностных слоях, падает с глубиной и только в придонном слое вновь повышается. В реках определенной закономерности в распределении микроорганизмов по глубине не отмечается вследствие течения и перемешивания воды.

На количественное содержание и распределение сапрофитных микробов в поверхностных водоемах оказывает влияние ряд других факторов. Наиболее значительными среди них являются выпуски хозяйственно-бытовых сточных вод, которые содержат миллионы и даже миллиарды бактерий в 1 мл. В местах выпуска стоков в водоемы и вблизи их количество сапрофитных микробов резко возрастает, а по мере удаления от выпуска уменьшается, особенно это прослеживается в зимний период, когда отмечается наибольшее количество сапрофитных микробов. Это объясняется тем, что в зимний период резко замедляются процессы самоочищения воды и удлиняются сроки выживания бактерий. Зимой, благодаря ледяному и снежному покровам, а также слабой инсоляции, бактерии не подвергаются действию ультрафиолетовых лучей. Зимой замедляется и развитие зоопланктона — пожирателя бактерий.

Со спуском стоков в водоем поступает также большое количество органических веществ, которые в свою очередь стимулируют развитие сапрофитных микроорганизмов. Особенно развитие указанных микроорганизмов характерно для поверхностных водоемов в паводковый период, когда резко возрастает сток с поверхности водосбора, значительно увеличивая скорость роста и размножения сапрофитов.

Весьма мощным экологическим фактором, влияющим на скорость размножения бактерий в благоприятной среде, является температура воды. При повышении ее до 20—25° С нарастает интенсивность метаболизма микробных клеток, ускоряется их размножение. Повышение температуры воды стимулирует также развитие фитопланктона, а затем и его отмирание; это в свою очередь ведет к обогащению воды органическими веществами и косвенно к увеличению числа сапрофитных микроорганизмов. При этом непосредственное влияние температуры на развитие микробов оказывается значительно слабее, чем влияние накопления органических веществ.

Сапрофитные микроорганизмы вместе с фитопланктоном служат пищей для многих представителей зоопланктона. Поэтому в период массового развития зоопланктона в сильно загрязненных водоемах количество сапрофитных бактерий в воде снижается. Задержку в развитии сапрофитных микроорганизмов вызывают и фитопланктонные организмы, выделяющие в окружающую среду вещества, обладающие бактерицидными свойствами [37].

Состав сапрофитной микрофлоры водоемов весьма разнообразен. При этом, чем более богата вода органическими веществами, тем беднее видовой состав микрофлоры, и, наоборот, в водах мало загрязненных он более разнообразен. В чистых водоемах до 80% всей аэробной сапрофитной микрофлоры приходится на долю кокковых форм, остальные 20 % — палочковидные. Наиболее часто в воде встречаются: Micrococcus candicans, Bacterium aquatilis communis, Micrococcus roseus, Pseudomonas fluorescens, Sarcina lutea, Torula rosea и др.

Анаэробных видов в чистой воде бывает обычно очень немного. Изредка в посевах на чашках вырастают Serratia marcescens, Chromobacterium violaceum, Bacillus cereus, Bacillus mycoides. Последний микроорганизм является типичным представителем почвенной микрофлоры и может быть обнаружен в посевах воды в небольшом количестве (1—5 экземпляров в 1 мл), лишь в период паводков, после сильных дождей или во время сильного волнения воды в местах размыва берегов. На качественный состав микроорганизмов отчасти накладывает свой отпечаток география. Так, в южных морях видовой состав бактерий несколько богаче, чем в северных [38].

Учет сапрофитных аэробных микроорганизмов проводят через 24 часа выращивания при температуре 37 °С или после двухсуточной инкубации посевов при температуре (20-22) °С на нейтральном питательном агаре. Однако этим микробиологическим методом учитывают не всю сапрофитную, аэробную микрофлору воды, а только некоторую ее часть. С увеличением срока инкубации посевов увеличивается и количество колоний, выросших на ППС [39].

Значительное влияние на количество сапрофитов, выделяемых из воды, оказывает температура выращивания. При инкубации посевов чистой воды при температуре 37 С вырастает меньшее количество колоний, чем при температуре (20-22)° С. При анализе хозяйственно-бытовых сточных вод количество формирующихся колоний при той и другой температуре оказывается близким.

Самоочищение водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами является, многостадийным биогеохимическим процессом, где микробное окисление углеводородов - ведущий фактор процесса элиминации нефти. В силу высокой пластичности обменных процессов микробные популяции являются мощным фактором процессов самоочищения природных вод [40, 19]. В результате деятельности микроорганизмов происходит трансформация нефти до простых соединений и дальнейшее их включение в общий круговорот углерода. При попадании в морскую среду нефть и нефтепродукты быстро (в течение часов и суток) перестают существовать как исходные субстраты и разделяются на агрегатные фракции в виде поверхностных пленок, растворенных и взвешенных форм, эмульсий, осажденных на дне твердых и вязких компонентов и аккумулированных в водных организмах соединений, причем доминирующей миграционной формой обычно является эмульгированная и растворенная нефть [10]. Находящуюся в воде нефть, можно лишь условно назвать нефтью, поскольку под влиянием внешних факторов она очень быстро теряет свои первоначальные, присущие сырой нефти, качества. Фактически это уже не нефть, а комплекс углеводородов и некоторое количество других соединений, количественный и качественный состав которых намного отличается от первоначального, и тем больше, чем больше нефть находилась в воде [40]. В первые часы появления нефтяного загрязнения в его разрушении доминируют физико-химические процессы, интенсивность которых зависит от свойств конкретного вида нефти, ее плотности, вязкости, коэффициента теплового расширения, температуры воздуха и солнечного освещения. Под действием физических факторов происходит значительное перемещение и преобразование попавшей в море нефти. Однако физические факторы являются лишь фоном, на котором происходит коренная деградация нефти химическим или биологическим путем. Химическое окисление или самоокисление нефти может быть значительным (10-50 % биохимического окисления). По материалам исследований, проводившихся в Каспийском море, до 60 % нефти может окисляться химическим путем. В работе А.Н.Зубакиной, в которой представлены результаты сопоставления химического и бактериального окисления при различных температурах, показано преимущество бактериального окисления над химическим [41].

В отдельную группу выделяют углеводородокисляющих представителей гетеротрофных микроорганизмов (УВОМ), способных к окислению нефтяных углеводородов. Изучение УВОМ в природных экосистемах обычно связывают с загрязнением их нефтью и нефтепродуктами. Некоторыми отечественными исследователями было предложено использовать их численность для того, чтобы картировать загрязненность водных экосистем нефтью [10, 42, 43], а саму группу микроорганизмов, способных к росту на нефти и нефтепродуктах, считать «индикаторной». Однако известно, что углеводородокисляющие бактерии широко распространены в природе, их пищевые потребности разнообразны и среди них нет узкоспециализированных форм [44]. По данным литературы, эта группа бактерий является постоянным компонентом микробиоценозов, независимым от уровня загрязнения нефтепродуктами [45, 46]. Микроорганизмы, способные к деструкции нефтяных углеводородов, могут входить в различные физиологические группы, в том числе сапрофитные, олиготрофные и фенолокисляющие, поэтому их можно считать гипотетически активными.

2.2 Методические подходы к микробиологической оценки почв

Сегодня земельный фонд России составляет более 1700 млн га [47], большую часть которого составляют леса и сельскохозяйственные угодья (рисунок 1).

Рисунок 1. Структура земельного фонда России

1 — земли сельскохозяйственных пред­п риятий; 2 — земли промышленности, транс­порта, военных организаций; 3 — земли вод­ного фонда; 4 — земли природоохранного назначения; 5 — земли населенных пунктов; 6 — земли государственного запаса; 7 — земли лесохозяйственных предприятий

Из 186 млн га сельскохозяйственных угодий 53,6 га подвержены эрозии, 40 млн га занимают засоленные и солонцовые почвы, 26 млн га переувлажнены и заболочены, 73 млн га являются кислыми, 12 млн га засорены камнями, 7 млн га заросли кустарником, мелколесьем, около 5 млн га загрязнены радионуклидами [47]. Для наибольшей части территорий страны самой острой признана проблема нарушения земель в процессе хозяйственной деятельности и невыполнения обязательных работ по их рекультивации. Особенно это касается регионов с развитой добывающей промышленностью и северных территорий с низким по­тенциалом самовосстановления эко­систем на нарушенных землях. Следующая по значимости проблема - загрязнение и захламление земель, приобретающая характер экологического кризиса.

При прогрессивно нарастающих антропогенных нагрузках на земли необходимо создать систему наблюдений за состоянием и использованием земель с целью своевременного выявления изменений, их оценки, предуп­реждения и устранения последствий негативных процессов. Сегодня систе­мы мониторинга земель создаются на национальном уровне [48].

В России наиболее эффективный путь реализации мониторинга земель - организация взаимосвязи между сложившимися федеральными и региональными системами наблюдений, характеризующими состояние земель. Этот путь обеспечивает интегрирование мониторинга земель в Единую государственную систему экологического мониторинга России (ЕГСЭМ).

В 1992 г. постановлением Правительства Российской Федерации утверждено Положение о мониторинге земель в Российской Федерации. В соответствии с этим решением в Российской Федерации ведется мониторинг земель, представляющий собой систему наблюдений за состоянием земельного фонда для своевременного выявления изменений, их оценки, предупреждения и устранения последствий негативных процессов. Объектом мониторинга земель являются все земли Российской Федерации, независимо от форм собственности на землю, целевого назначения и характера использования.

Мониторинг земель охватывает земли:

сельскохозяйственного назначения;

населенных пунктов;

промышленности, транспорта, связи, радиовещания, телевидения, ин­форматики и космического обеспечения, энергетики, обороны и иного назначения;

лесного фонда;

водного фонда;

запаса.

Общее состояние почвенных и земельных ресурсов в России характеризуется в ежегодном Государ­ственном докладе «О состоянии и использовании земель Российской Феде­рации». Состояние почвенных ресурсов с точки зрения санитарной безо­пасности представляется в Государственном докладе «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации», а с точки зрения экологической безопасности - в Государственном докладе «О состоянии окружающей природной среды Российской Федерации».

Проблема восстановления нарушенной почвы в настоящее время является крайне актуальной. На ее решение затрачиваются огромные средства. Активное участие в этих работах принимают ученые-почвоведы. Основные принципы научного почвоведения, заложенные в 80-х годах ХIХ века В.В.Докучаевым, широко применяются современными исследователями при решении проблем загрязнения земельных ресурсов.

Под научным определением почвы принято понимать поверхностный слой суши земного шара, который образуется в результате изменения горных пород при воздействии биоты, климата и других факторов почвообразования.

Важнейшее свойство почвы - плодороди, определяет ее очевидную значимость как основного средства сельскохозяйственного производства. Кроме того, этот относительно маломощный слой суши участвует во всех важнейших процессах функционирования неземных экосистем и биосферы в целом. Во всех этих процессах ключевую роль играют микроорганизмы, которые обитают в почве и выполняют многообразные экосистемные функции.

Именно почвенные организмы отвечают за разложение органического вещества, образовавшегося в наземной экосистеме при фотосинтезе, и снабжают растения доступными ресурсами. Они также играют существенную роль в формировании стабильных почвенных агрегатов.

Стоит отметить, что особенностью почвы является то, что она является природным местообитанием различных организмов. Условия для жизнедеятельности биоты почвы не постоянны, а меняются в зависимости от климатических и других факторов. Так, определяющую роль в форми­ровании техногенных экосистем, в том числе и микробных почвенных популяций, играет комбинированный характер загрязнений и различные факторы: температура, значения рН, уровень минерализации среды [49].

Известно, что сообщества микроорганизмов играют важную роль в биогеохимических циклах на Земле. Они осуществляют переработку органических остатков на поверхности, в почве, в пресноводных и морских водоемах, участвуют в формировании газового состава атмосферы. Кроме того, они выполняют основную функцию в ряде биотехнологических процессов, таких, как очистка сточных вод, переработка муниципальных и сельскохозяйственных отходов, выщелачивание металлов из руд. Поэтому контроль состава микробного сообщества, в том числе и в почве, представляется практически важной задачей как средство получения исходных данных для последующего регулирования технологического процесса или реагирования на изменение эко­логической ситуации.

До настоящего времени одним из наиболее распространенных методов контроля за составом микробного сообщества является метод учета численности микроор­ганизмов, выросших в виде колоний на ПС. При этом определяются в целом группы, которые объединяют организмы из сообщества по функцио­нальным, трофическим или метаболическим признакам, например метанокисляющие, сульфатвосстанавливающие, метанобразующие. По данному методу идентификация до рода, а тем более до вида микроорганизма, не проводится [50].

Количественный учет микроорганизмов почвы является одним из важнейших компонентов характеристики микрофлоры почвы.

Методы количественного учета микроорганизмов почвы делятся на две принципиально отличные группы: 1) прямые микроскопические ме­тоды (метод Виноградского и его модификации, люминесцентно-микроскопический и электронно-микроскопический методы); 2) учет количе­ства микроорганизмов на питательных средах (метод посева из разве­дении на твердые или в жидкие среды, метод почвенных комочков, метод рассева почвенного мелкозема и т.д.).

Для учета всех почвенных микроорганизмов или хотя бы большинства из них необходимо сочетание различных методов. Наибольшее количество микроорганизмов можно выявить с помощью прямых микроскопических методов, но ни один из них не дает возможности учесть все микроорганизмы почвы. Например, люминесцентно-микроскопический метод, являющийся одним из наиболее совершенных в настоящее время, дает возможность подсчитать бактерии, актиномицеты, грибы, дрожжи, водоросли, простейших животных, нематоды, но с его по­мощью нельзя видеть ультрамикробов, которые выявляются только при использовании электронного микроскопа. Нельзя подсчитать железомарганцевые микроорганизмы, покрытые окислами железа и марганца, которые, как показали Т. В. Аристовская и др., наиболее полно выявляются при прямом микроскопическом изучении почвенных шли­фов [цит. по 49]. Несмотря на отмеченные ограничения, прямые микроскопические методы дают возможность подсчитать гораздо большее количество мик­роорганизмов, чем методы посева на питательные среды. Посевы, если они производятся на одну питательную среду, дают возможность учесть только 1% или даже 0,1-0,01% от общего количества микро­организмов, которые находятся в почве, и то только при том условии, что берется среда, не отличающаяся большой элективностъю, такая среда, на которой растет по возможности большее количество микро­организмов. Различные авторы используют для этих целей разные cреды: почвенные агаризованные вытяжки, почвенный агар, голодный агар, разбавленный мясо-пептонный агар (МПА), крахмало-аммиачный агар (КАА), маннитно-аспарагиновый агар (МАА), глицерино-пептонный агар (ГПА) и т. д.

Для более полного выделения микроорганизмов из почвы необходи­мо применять большой набор различных питательных сред и условий культивирования. Необходимо на разных средах и в разных условиях культивировать аэробов и анаэробов, термофилов, мезофилов и психрофилов, автотрофов и гетеротрофов, прототрофов и ауксотрофов, обыч­ных микробов и олиготрофов, микроорганизмов, развивающихся при высоких и низких концентрациях солей, при различных значениях рН, при различном парциальном давлении газов над питательной средой (особенно О₂ и СО₂), на средах, подавляющих развитие конкурентов и антагонистов к данной группе микроорганизмов, и т. д.

Для правильного количественного учета микроорганизмов на пита­тельных средах необходимо проводить посев из суспензии, в которой микроорганизмы должны находиться в виде одиночных свободноплавающих клеток, и каждая клетка, попав на питательную среду, должна дать рост. Для выполнения первого условия в почвенной микробиологии обычно рекомендуют применять 5-10-минутное перемешивание (кото­рое неправильно называют взбалтыванием) водной почвенной суспен­зии в колбе. Однако такая обработка не может обеспечить выполне­ния поставленного условия.

При использовании прямых микроскопических методов перед про­ведением подсчета клеток также необходимо добиться такого состоя­ния суспензии, при котором были бы видны все клетки, чтобы их мож­но было точно подсчитать. Клетки должны быть равномерно распре­делены в почвенной суспензии. При проведении прямых микроскопических подсчетов микроорганизмов выполнению этих условий не уделялось должного внимания [51].

Ф. Н. Германов, основываясь на работах К. К. Гедройца, предложил при учете микроорганизмов с помощью прямого мик­роскопического метода Виноградского пептизировать почву 0,0004 н. NаОН после удаления кальция с помощью 1 н. НСl. Такая предвари­тельная обработка давала возможность сильно повысить определяемое количество микроорганизмов, причем можно думать, что учитывались еще не все клетки, так как применялась обработка почвы на фильтре и часть клеток могла адсорбироваться на нем [цит. по 52].

Методы подготовки почв к прямому микроскопическому исследова­нию, но уже с использованием люминесцентной микроскопии, разраба­тывались Ожье и Пошоном, Куроном и Хомригхаузеном. Ожье и Пошон предложили применять обработку почвенной сус­пензии раствором пирофосфата и получили положительный эффект. Хомригхаузен и Ромер нашли, что этот прием лучше заменить продолжительным встряхиванием почвенной сус­пензии со стеклянными бусами [51].

Развитие экологии микроорганизмов целиком зависит от совершенствования применяемых методов и методических подходов. Методы, разработанные Л.Пастером и Р.Кохом, позволили выделять чистые культуры микроорганизмов из их природных местообитаний и изучать их уникальные свойства. Эти методы лишь косвенно могут помочь экологу-микробиологу, имеющему дело с сообществами микробов, где приходится применять более современные подходы, такие, как флуоресцентные генетические пробы, которые позволяют следить за развитием популяций микроорганизмов в сложных микробных сообществах, использовать радиоактивные и стабильные изотопы и тонкие химические анализы с применением точной аналитической техники. Метод чистых культур только косвенно способствует изучению микробных взаимодействий [19].

Оценка активности отдельных биогенных процессов в природе носит интег­ральный характер деятельности сообщества как целого, не позволяя оценить роль отдельных компонентов сообщества. Характеристика сообщества, основанная на выделении чистых культур, значительно ограничивает рамки исследования вследствие трудности выделения и больших экономических затрат, необходимых для исследования широкого ряда штаммов.

В настоящее время ощущается не­обходимость в методах, которые позволяли бы разделить природное микробное сообщество на компоненты без выделения чистых культур. Такими методами, принятыми в микробной экологии, являются методы, основанные на анализе нуклеотидных последовательностей ДНК, РНК, а также жирных кислот микро­организмов. Информацию о структуре микробного сообщества позволяет дать исследование его суммарной биомассы с помощью хромато-масс-спектрометрии по наличию специфических маркеров [53].

Особенность почвы как природного местообитания различных организмов состоит в том, что условия для жизнедеятельности биоты не постоянны, а меняются в зависимости от климатических и других факторов.

Применительно к почве следует отметить, что она представляется не только гетерогенной, но и гетерохронной средой обитания, параметры которой изменяются во времени. Гетерохронность почвенного микробного сообщества выявляется, в частности, в динамике показателя k=M/P, отражающего отношение между количеством бактерий по данным микроскопии (М) к количеству, найденному по посеву (Р). Для анализа различий между показателями численности бактерий в почве, по данным микроскопии и посева, запишем следующее равенство:

М=Р1+Р2+Р3+Р4+Р5,

где

М-численность бактерий, по данным микроскопии;

Р1-выросшие и учтенные на данной среде бактерии;

Р2-не учтенные на данной среде бактерии с иными пищевыми потребностями или другими требованиями к условиям культивирования;

Р3-бактерии, неучтенные в связи с их медленным ростом;

Р4-бактерии, растущие на данной среде, но не учитываемые из-за стрессов;

Р5-мертвые клетки.

Микробное население, функционирующее в данной сложной гетерогенной и гетерохронной среде, выполняет многообразные фундаментальные экосистемные функции.

Вполне очевидно, что природные почвенные и подпочвенные микроорганизмы не являются случайным набором разнообразных микробных популяций, а в определенном пространственно-временном масштабе действуют как телеономическая система, способная к противодействию и самовосстановлению [19].

В почвенной микробиологии вопрос об адсорбции микроорганизмов представляет особое значение, так как почва является специфическим субстратом с чрезвычайно развитой твердой поверхностью. Выяснение вопроса о специфике жизнедеятельности адсорбированных микроорганизмов необходимо для правильного понимания протекания микробиологических процессов в почве. В связи с адсорбцией встает вопрос о разработке метода правильного количественного их учета, о возможности передвижения микроорганизмов в почве и др. Без предварительной разработки этих вопросов невозможно разрешение ряда теоретических и практических проблем, стоящих перед почвенной микробиологией: количественный учет микроорганизмов почвы, определение их биомассы. [51].

Возросший антропогенный пресс стимулирует разработку новых и модификацию существую­щих способов оценки качества основных компо­нентов окружающей среды - почв, воды, воздуха. Применяемая сейчас система контроля основана на химико-аналитическом определении отдель­ных поллютантов и соблюдении на практике ГОСТов и ПДК на них. Хотя число последних превышает 1000 [54], они далеко не охватывают весь спектр токсических поллютантов, общее число которых, по данным Международного регистра, уже перевалило за 50000. Причем некоторые ре­комендуемые анализы сложны, дорогостоящи, ос­нованы на использовании импортных реактивов, приборов, а поэтому малодоступны практике.

Возможным выходом из этой ситуации может быть применение суммарных способов определе­ния или биотестирования [55, 56]. В отличие от хими­ко-аналитических исследований такой подход позволяет в одном тесте определить суммарное присутствие всех, в том числе и не определяемых пока химическими анализами, токсикантов, выявлять не отдельные вредные вещества, а об­щебиологический эффект их действия, одновре­менно оценить возможные эффекты их взаимо­усиления, ослабления и в первом приближении дифференцировать токсиканты и смеси по быст­роте их проникновения, действия, детоксикации и элиминации. При этом микробиотесты выгодно отличаются относительной простотой, экспрессностью, дешевизной и большой численностью индикаторной популяции [57].

Как уже отмечалось выше, почва является средой обитания микробиологического сообщества, отношения в котором построены на фукциональных, трофических или метаболических отношениях.

Известно, что функциональное биоразнообразие микроорганизмов – деятельность сообщества, культивируемое подмножество которого можно описать в его метаболическом спектре. Эффект исчезновения определенных функций в экосистеме является сигналом тревоги об реальном и зачастую необратимом изменением системы.

Единственно доступным на сегодняшний день и наиболее удобным инструментом измерения функционального разнообразия является метод мультисубстратного тестирования (МСТ) [58]. Суть метода состоит в одновременном контроле за интенсивностью потребления сообществом большого количество моносубстратов путем инкубации образца в планшете для иммунологических тестов в каждой ячейке которой имеется единственный источник углерода, набор минеральных солей и индикатор дыхания. Измерение оптической плотности содержимого ячеек такой планшеты после инкубации дает исследователю многомерные спектры потребления субстратов. Они являются свообразным «отпечатком пальца» сообщества и незаменимы в задачах идентификации и контроля над нарушениями в консорциуме микроорганизмов [59].

Смысловая трактовка результатов МСТ заключается в анализе ряда закономерностей, помогающем связать потребление субстратов с теми или иными условиями или процессами [60].

Следует отметить, что вышеприведенные методы оценки почвы по микробиологическим показателям являются, в основном, научно-исследовательскими изысканиями, позволяющими косвенно охарактеризовать ее качество. Однако к настоящему времени разработаны и внедрены в практику международные стандарты, дающие системную оценку различных типов почв именно по микробиологической активности. Так, международный стандарт ИСО 14240-1 [61] устанавливает метод определе­ния активной аэробной гетеротрофической микробной биомассы в аэриро­ванных сельскохозяйственных и минеральных почвах. Сущность метода заключается в добавлении в исследуемую почву ра­створа глюкозы до достижения максимального газовыделения. По уровню газовыделения можно оценить количество активной биомассы.

Международный стандарт ИСО 14240-2 устанавливает метод определе­ния микробной биомассы измерением органической биомассы экстракта, состоящего главным образом из инактивированных (убитых) мик­роорганизмов. Сущность метода заключается в обработке пробы почвы парами хлоро­форма в течение 24 ч. Затем экстрагированием раствором сульфата калия из пробы удаляется органический углерод с последующим определением микробной массы. Данный метод обычно называют фумигационно - экстракционным ме­тодом [62].

Таким образом, проведенный анализ показал, что существующие в настоящее время методические подходы к анализу микробных сообществ и систем позволяют качественно охарактеризовать почву и создавать условия прогнозирования развития поведения загрязняющих ее веществ.

2.3 Материалы и методы

2.3.1 Штаммы микроорганизмов

Объектом исследования являлись пробы воды и грунта со станций II уровня производственно-экологического контроля ООО «НК «Приазовнефть» из акватории Азовского моря, координаты отбора которых представлены в таблице.

Таблица 1 - Координаты отбора проб со станций II уровня

Номер станции	Код (идентификатор)	Долгота	Широта
103	G2-1	37,34847	45,43549
92	G2-2	37,19773	45,35381
96	G2-3	37,29977	45,35381
82	G2-4	37,19716	45,37023
83	G2-5	37,2482	45,37102
85	G2-6	37,29923	45, 3718
87	G2-7	37,35027	45,37254
91	G2-8	37,45236	45,37397
65	G2-9	37,29815	45,40777
67	G2-10	37,4003	45,40925
71	G2-11	37,50246	45,41063
42	G2-12	37,24597	45,44297
47	G2-13	37,45039	45,44593
51	G2-14	37,55077	45,44701
29	G2-15	37,22089	45,45973
32	G2-16	37,375	45,45833
21	G2-17	37,29599	45,47972
23	G2-18	37,39827	45,4812
26	G2-19	37,50055	45,48259
28	G2-20	37,54985	45,48299
2	G2-21	37,24373	45,51492
4	G2-22	37,34607	45,51644
6	G2-23	37,44842	45,51788
9	G2-24	37,54892	45,51897
6*	G3-10	37,58175	45,45854
Примечание. *Станция III уровня

Отбор проб грунта и морской воды осуществляли в летне-осенний период. Пробы воды отбирали из поверхностного горизонта (10-20) см в районах предполагаемого бурения. Для отбора проб воды использовали стерильный батометр – бутылку. Пробы помещали в стерильные полимерные контейнеры, которые хранились и транспортировались при температуре (4-6) С. Пробы грунта отбирали в полиэтиленовые пакеты, которые после отбора герметизировались. Транспортировка и хранение осуществлялась в аналогичных условиях.

Агаровые культуры изолятов микроорганизмов, выделенных из проб грунта и морской воды, хранили на полужидком агаре при температуре (0 – 4) С и пересевали раз в месяц. Подготовку, разведение и посев культур проводили в соответствии с указаниями ГИСК им. Л.А. Тарасевича [63].

2.3.2 Питательные среды и дополнительные растворы

Жидкие и плотные питательные среды (ПС) готовили из сухих коммерческих препаратов в соответствии с прилагаемыми к ним инструкциями, их состав и характеристики удовлетворяли заданным требованиям и представлены в ходе изложения материала.

2.3.3 Сырье, реактивы, препараты

В работе использовали сырье, реактивы, препараты, отвечающие требованиям действующих нормативных документов.

2.3.4 Методы исследований

Пробы грунта, полученные со станций, первоначально подвергали внешнему осмотру. При этом руководствовались требованиями Международного стандарта ИСО 11259 [64], устанавливающего описание почв и экологическое состояние окружающей среды на основании требований ФАО. Определяемыми характеристиками являлись текстура, структура, наличие примесей и крупных элементов, влажность, содержание органического материала, наличие газовыделения, уплотняемость, пористость.

При микробиологических исследованиях определяли количество сапрофитных и олиготрофных микроорганизмов с помощью подсчета колоний на поверхности агаризованных сред [65]. Количество амилолитических, липолитических, фенолокисляющих, углеводородоокисляющих и ксилолокисляющих микроорганизмов определяли методом предельных разведений [66]. Идентификацию микроорганизмов проводили с помощью мультисистемы ENTERO и NEFERM фирмы «Lachema».

2.3.5 Приборы и оборудование

Анализ проб воды и грунта, приготовление ПС и дополнительных растворов, микробиологический контроль и оценку результатов проводили на лабораторной базе биологического факультета ВятГУ.

2.3.6 Методы статистической обработки экспериментальных данных

Результаты экспериментальных исследований представлены в виде средних арифметических значений с определением доверительного интервала при уровне вероятности, равном 95%.

Статистическую обработку проводили методами вариационной статистики с использованием параметрического критерия Стьюдента, а также методом корреляционного анализа. Обработку данных осуществляли с помощью компьютера, с использованием пакета программ вариационной статистики MS Excel 2002.

2.4 Выделение и идентификация микроорганизмов

Бактерии выделяли из проб морской воды чашечным методом на ПС на основе перевара Хоттингера с добавлением 1% NaCl. Чашки Петри с посевами образцов воды инкубировали в термостате при температуре (27- 29)С и просматривали каждые 24 часа. По окончании инкубирования на поверхности агаровых пластин наблюдался единичный рост колоний микроорганизмов, которые бактериологической петлей переносили в бульон Хоттингера. Через двое суток суспензию микроорганизмов рассевали до единичных колоний на агар Хоттингера, агар Фробишера и агар с конго-красным для изучения морфологии выросших колоний. Агар Фробишера готовили в соответствии с рекомендациями работы [67].

Выросшие агаровые культуры отбирали бактериологической петлей для приготовления мазков и окраски по Граму, которые просматривали с помощью светового микроскопа.

Параллельно выросшие агаровые культуры инокулировали (каждую в отдельности) в две пробирки, содержащие бульон Хоттингера, глюкозу и бромтимоловый синий (индикатор). Одну из этих пробирок заливали стерильным вазелиновым маслом для исключения контакта питательной среды с кислородом воздуха. Пробирки с посевами культур инкубировали при температуре (27-29)С в течение 48 часов и выявляли способность бактерий окислять и/или ферментировать глюкозу в тесте Хью-Лейфсона [68]. Как при ферментации, так и при окислении глюкозы рН среды сдвигается в кислую сторону, цвет среды меняется с бутылочно-зеленого на желтый (положительная реакция). При отрицательной реакции цвет среды не меняется. Результаты изучения культур бактерий приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Культурально-морфологические свойства бактерий

№ п/п	Первичное обозначение культуры бактерий	Характеристика колоний, выросших на питательной среде …			Микроскопия окрашенных по Граму мазков
		агар Хоттингера	агар Фробишера	агар с конго-красным
1	G 2-4	Неправильной формы, бугристые лимонно-желтые; диаметр 3-3,5 мм	Шероховатые, неправильной формы, светло-желтые; диаметр 3-3,5 мм	Неправильной формы, бесцветные, диаметр 3-4 мм	Грамотрицательные палочки, единичные или по 3-5 в цепочке
2	G 2-6	Шероховатые, лимонно-желтые, диаметр 3-3,5 мм	Шероховатые, светло-желтые; диаметр 3-4 мм	Шероховатые, бесцветные; диаметр 3-3,5 мм	Мелкие грамотрицательные палочки
3	G 2-9	Гладкие, блестящие; диаметр 2 мм	Белые, блестящие; диаметр 2 мм	Рост отсутствует	Мелкие грамотрицательные палочки
4	G 2-11/1 – 1 тип	Шероховатые, окрашены в коричневый цвет; диаметр 2-3 мм	Шероховатые, бесцветные, матовые, диаметр 1,5-2 мм	Шероховатые, бесцветные, диаметр 2-2,5 мм	Мелкие грамотрицательные палочки

Продолжение таблицы 2.

№ п/п	Первичное обозначение культуры бактерий	Характеристика колоний, выросших на питательной среде …			Микроскопия окрашенных по Граму мазков
		агар Хоттингера	агар Фробишера	агар с конго-красным
5	G 2-11/1 – 2 тип	Гладкие, блестящие; диаметр 2 мм	Гладкие, блестящие, слегка желтые; диаметр 1,5 мм	Гладкие, блестящие, красного цвета; диаметр 2-2,5 мм	Мелкие грамотрицательные палочки
6	G 2-11/2 – 1 тип	Гладкие, блестящие с неровными краями, «водянистые»; диаметр 3-4 мм	Гладкие, блестящие, белесые; диаметр 2-3 мм	Рост отсутствует	Отдельно расположенные грамотрицательные палочки с полярными включениями
7	G 2-11/1 – 2 тип	Шероховатые с неровными краями, светло-коричневые; диаметр 3-4 мм	Шероховатые с неровными краями, чуть желтые; диаметр 2-3 мм	Рост отсутствует	Тонкие удлиненные грамотрицательные палочки с полярными включениями
8	G 2-15 – 1 тип	Белые, чуть шероховатые; диаметр 1,5-2 мм	Белые, блестящие; диаметр 2 мм	Круглые, бледно-розовые; диаметр 2-2,5 мм	Отдельные и расположенные группами грамположительные кокки
9	G 2-15 – 2 тип	Белые с желтизной, округлые; диаметр 2-2,5 мм	Белые, блестящие, диаметр 2,5 мм	Круглые, окрашенные в красный цвет; диамтер 2,5-3 мм	Грамположительные кокки, расположенные гроздями
10	G 2-17 – 1 тип	Матовые, округлые беловатые; диаметр 2-3 мм	Матовые, округлые беловатые; диаметр 2,5-3 мм	Круглые, окрашенные в красный цвет; диаметр 2,5-3 мм	Грамположительные кокки, расположенные гроздями

Продолжение таблицы 2.

№ п/п	Первичное обозначение культуры бактерий	Характеристика колоний, выросших на питательной среде …			Микроскопия окрашенных по Граму мазков
		агар Хоттингера	агар Фробишера	агар с конго-красным
11	G 2-17 – 2 тип	Округлые, лимонно-желтые; диаметр 2-2,5 мм	Округлые, слегка желтые; диаметр 2-2,5	Круглые, слегка розовые; диаметр 2,5-3 мм	Овоидные мелкие, грамположительные палочки
12	G 2-18/1 – 1 тип	Неправильной формы, бугристые, желтые; диаметр 3-4 мм	Шероховатые, неправильной формы, лимонно-желтого цвета; диаметр 3-3,5 мм	Неправильной формы, бледно-розового цвета; диаметр 2-3 мм	Грамотрицательные палочки, единичные или по 3-5 в цепочки
13	G 2-18/1 – 2 тип	Неправильной формы, бугристые, лимнно-желтые; диаметр 3-3,5 мм	Шероховатые, неправильной формы, светло-желтого цвета; диаметр 3-4 мм	Неправильной формы, бледно-розового цвета; диаметр 3-4 мм	Отдельно расположенные грамотрицательные палочки
14	G 2-18/2 – 1 тип	Неправильной формы, бугристые лимонно-желтые; диаметр 3-3,5 мм	Шероховатые, неправильной формы, светло-желтые; диаметр 3-3,5 мм	Неправильной формы, бесцветные, диаметр 3-4 мм	Отдельные чуть изогнутые грамотрицательные палочки
15	G 2-18/2 – 2 тип	Шероховатые, лимонно-желтые, диаметр 3-3,5 мм	Шероховатые, светло-желтые; диаметр 3-4 мм	Шероховатые, бесцветные; диаметр 3-3,5 мм	Удлиненные грамотрицательные отдельно расположенные палочки
16	G 2-23 –1 тип	Неправильной формы, бугристые, расползающиеся; 3-4 мм в поперечнике	Шероховатые, неправильной формы, «водянистые»; 3-4 мм в поперечнике	Рост отсутствует	Грамотрицательные палочки, формирующие цепочки

Окончание таблицы 2.

№ п/п	Первичное обозначение культуры бактерий	Характеристика колоний, выросших на питательной среде …			Микроскопия окрашенных по Граму мазков
		агар Хоттингера	агар Фробишера	агар с конго-красным
17	G 2-23 – 2 тип	Гладкие, блестящие, неправильной формы, «водянистые»; 3-4 мм в поперечнике	Шероховатые, неправильной формы, «водянистые»; 3-3,5 мм в поперечнике	Рост отсутствует	Отдельные короткие грамотрицательные палочки
Примечания: 1. В тесте Хью-Лейфсона все исследования бактерий давали отрицательную реакцию: цвет среды не менялся, оставаясь бутылочно-зеленым. Контрольный штамм E.coli 803 окислял и ферментировал глюкозу: цвет среды менялся с бутылочно-зеленого на желтый.

Изучение культурально-морфологических свойств бактерий, показало, что исходные культуры – смешанные, состоящие из бактерий двух типов. Большинство из них являются грамотрицательными палочками и лишь культура с порядковым номером 11 (G 2-17 – 2 тип) состояла из грамположительных палочек.

Отдельно отстоят культуры с порядковыми номерами 8,9,10 представляющие собой грамположительные кокки.

Следующим этапом исследований стала идентификация всех 14 культур с использованием ряда биохимических тестов, а также НЕФЕРМ теста 24 фирмы PLIVA-Lachema. Набор диагностический НЕФЕРМ тест 24 предназначен для биохимической идентификации грамотрицательных неферментирующих бактерий. Система представляет собой микротитровальную пластину, содержащую ячейки с высушенными питательными средами и субстратами для 24 тестов: индол, аргинин, уреаза, лизин, глюкоза, фруктоза, инозитол, сахароза, фосфатаза, -галактозидаза, -глюкозидаза, N-ацетил --D-глюкозаминидаза, маннитол, ксилоза, целлобиоза, галактоза, нитраты, нитриты, эскулин, -глютамилтрансфераза, лактоза, мальтоза, трегалоза и цитрат Симмонса.

Дополнительно выполнялся тест для выявления цитохромоксидазы с использованием диагностической полоски ОКСИ - тест.

Идентификацию бактерий проводили в строгом соответствии с инструкцией по использованию НЕФЕРМ тест 24. Вначале с чистыми культурами выделенных микроорганизмов были поставлены тесты по выявлению цитохромоксидазы. Результаты оказались положительными для всех культур за исключением культуры с порядковым номером 10, микробы которой лишены этого свойства.

Для проведения идентификационного анализа с помощью индивидуальных планшетов приготовили суспензию исследуемых культур, мутность которых соответствует 2 степени по шкале мутности McFarland. Полученные суспензии инокулировали в индивидуальные планшеты, которые помещали в термостат на 48 часов при температуре 30С. При оценке результатов ориентировались по таблице «Интерпретация реакции» и по цветным реакциям контрольных штаммов. Результаты реакций заносили в бланки для регистрации результатов и определяли индивидуальный код для каждой культуры, а по книге кодов идентифицировали культуры микроорганизмов. Для более точной идентификации микроорганизмов, особенно в случае кокковых форм бактерий, использовали определитель Берджи [69]. Результаты идентификации микробных культур приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Идентификация исследуемых микроорганизмов с учетом таблицы «Интерпретация реакций» и индивидуальных кодов

№ п/п	Первичное обозначение культуры бактерий	Идентифицированный вид (род)	Распространенность в окружающей среде
1	G 2-4	Burkholderia cepacia	Широко распространены в природе. Некоторые штаммы патогенны для человека, животных или растений

Продолжение таблицы 3.

№ п/п	Первичное обозначение культуры бактерий	Идентифицированный вид (род)	Распространенность в окружающей среде
2	G 2-6	Agrobacterium radiobacter	Широко распространены в окружающей среде
3	G 2-9	Pantoea agglomerans	Широко распространены в окружающей среде
4	G 2-11/1 – 1 тип	Pseudomonas alcaligenes	Широко распространены в природе. Некоторые штаммы патогенны для человека, животных или растений
5	G 2-11/1 – 2 тип	Alcaligenes xilosoxidans ssp. denitrificans	Встречается в воде и почве; иногда вызывает оппортунистические инфекции у человека
6	G 2-11/2 – 1 тип	Alcaligenes faecalis type 2	Встречается в воде и почве
7	G 2-11/2 – 2 тип	Pseudomonas alcaligenes	Встречается в природе
8	G 2-15 – 1 тип	Marinococcus albus	Распространены в морской воде
9	G 2-15 – 2 тип	Marinococcus halophilus	Распространены в морской воде
10	G 2-17 – 1 тип	Marinococcus halophilus	Распространены в морской воде
11	G 2-17 – 2 тип	Kurthia zopfii	Широко распространены в окружающей среде, растут в присутствии NaCl
12	G 2-18/1 – 1 тип	Vibrio vulnificus	Широко распространены в морской воде и в устьях рек
13	G 2-18/1 – 2 тип	Vibrio vulnificus	Широко распространены в морской воде и в устьях рек
14	G 2-18/2 – 1 тип	Pseudomonas pseudoalcaligenes	Широко распространены в окружающей среде

Окончание таблицы 3.

№ п/п	Первичное обозначение культуры бактерий	Идентифицированный вид (род)	Распространенность в окружающей среде
15	G 2-18/2 – 2 тип	Pseudomonas alcaligenes	Широко распространены в окружающей среде
16	G 2-23 –1 тип	Pseudomonas alcaligenes	Широко распространены в окружающей среде
17	G 2-23 – 2 тип	Pseudomonas faecalis type 2	Встречается в воде и почве
Примечание: Культуры №№ 1-7, 9-14 – оксидазаположительные; культура № 8 - оксидазаположительная

Приведенные в таблице 3 данные свидетельствуют о различной таксономической принадлежности бактериальных культур, выделенных из морской воды. Они широко распространены в окружающей среде, некоторые из них могут быть патогенными для человека, животных и растений. Свойства бактерий также разнятся (таблица 2). Об этом свидетельствует и тот факт, что при высеве культуры бактерий на агар Хоттингера с добавлением генцианвиолета в соотношении 1:10000 на поверхности агаровых пластин не формируются колонии бактерий K. zopfii (порядковый номер № 11), P. alcaligenes и A. faecalis type 2 (порядковые номера 15 и 16).

2.5 Изучение количественных показателей популяции микроорганизмов акватории Азовского моря

2.5.1 Фоновое состояние аэробной микрофлоры в различных точках акватории Азовского моря

Фоновое состояние определяли в поверхностных водах Азовского моря, взятых в местах предполагаемого бурения.

Бактерии выделяли из проб морской воды чашечным методом на ПС на основе перевара Хоттингера с добавлением 1% NaCl. Чашки Петри с посевами образцов воды инкубировали в термостате при температуре (27- 29)С и просматривали каждые 24 часа. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Общее микробное число в образцах морской воды, отобранных со станций II уровня производственно-экологического контроля ООО «НК «Приазовнефть» из акватории Азовского моря ( Х±I₉₅, n=4)

Код станции	Количество сапрофитных бактерий в пробах воды (тыс ж.м.к.см^-3), отобранных в… 2006 г.
	июле	октябре
G 2-1	540±35	7±1,9
G 2-2	204±16	5±1,4
G 2-3	90±10	2,7±0,6
G 2-4	45±4	0,56±0,1
G 2-5	31±3	1,7±0,3
G 2-6	102±9	4,3±1,9
G 2-7	54±4	1±0,03
G 2-8	131±12	3±0,54
G 2-9	223±23	12±3,24
G 2-10	24±3	0,21±0,06
G 2-11	408±34	11±2,9
G 2-12	110±9	6,4±1,6
G 2-13	17±2	0,14±0,035
G 2-14	1,3±0,4	0,013±0,003
G 2-15	70±6	1,6±0,3
G 2-16	212±18	19,1±3
G 2-17	540±40	39±5
G 2-18	42±4	2±0,3
G 2-19	130±12	1,8±0,2
G 2-20	70±6	2,3±0,2
G 2-21	50±5	2,5±0,6
G 2-22	104±13	6±0,9
G 2-23	21±2	0,2±0,04
G 2-24	23±2	1,3±0,2

Результаты исследований, представленные в таблице 4, отражают общее количество аэробных микроорганизмов в отобранных пробах воды. Снижение содержания микроорганизмов в осенний период можно объяснить, тем, что температура окружающей среды снижается, уменьшается продукция фитопланктоном органического вещества, уменьшается метаболизм бактерий и скорость размножения. Указанные значения можно считать фоновыми для соответствующего периода.