Раздел III. Обмен веществ Лабораторная работа №9

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НЕОРГАНИЧЕСКОГО ФОСФАТА В ПРОЦЕССЕ СПИРТОВОГО БРОЖЕНИЯ

Цель работы – познакомиться с процессом спиртового брожения и доказательством его промежуточных продуктов.

Спиртовое брожение глюкозы протекает в анаэробных условиях под влиянием ферментов дрожжей.

Метод основан на определении неорганического фосфата, концентрация которого уменьшается за счет использования его на образование 1,3-дифосфоглицерата в процессе гликолиза.

Исследуемый материал: дрожжи.

Реактивы: 10% раствор трихлоруксусной кислоты; глюкоза; основной фосфатный буфер (растворяют 33,5 г NaOH в 400 мл воды в мерной колбе вместимостью 500 мл и добавляют 226,8 г KH₂PO_4, встряхивают до полного растворения, охлаждают и доливают водой до метки); 2,5% раствор молибдата аммония в серной кислоте (2,5 г молибдата аммония растворяют в 60 мл дистиллированной воды, фильтруют; раствор вносят в колбу на 100 мл; в другой колбе к 25 мл дистиллированной воды приливают 7,5 мл концентрированной серной кислоты; второй раствор приливают к первому, охлаждают и доводят дистиллированной водой до метки; раствор стабилен не менее месяца); 0,5% раствор аскорбиновой кислоты.

Оборудование: штатив с пробирками; ступка с пестиком; химический стаканчик; термостат или водяная баня на 37-38^ОС; воронки с фильтрами.

Ход работы. Заготавливают 4 пронумерованные пробирки и наливают в каждую по 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты.

В фарфоровой ступке растирают 1 г сухих дрожжей, 1 г глюкозы и 5 мл дистиллированной воды, добавляют 5 мл фосфатного буфера и перемешивают. До начала брожения 1 мл смеси переносят в 1-ю пробирку с трихлоруксусной кислоты. Трихлоруксусная кислота осаждает белки и ферменты и тем самым прекращают брожение.

Оставшуюся смесь переносят в стаканчик и помещают в термостат при температуре 37-38^ОС на 1,5 часа. Через каждые полчаса отбирают из стаканчика по 1 мл бродильной смеси и переносят в заготовленные пробирки с трихлоруксусной кислотой. Спустя 5 минут после взятия каждой пробы, содержимое пробирки фильтруют через складчатые фильтры в 4 пронумерованные пробирки и получают безбелковые фильтраты. Когда будет получен последний фильтрат со всеми пробирками проделывают молибденовую реакцию на фосфорную кислоту, в результате которой образуется комплексное соединение фосфорномолибденовокислый аммоний (NH₄)₃PO₄∙12MoO₃, которое в свою очередь при добавлении аскорбиновой кислоты восстанавливается с образованием молибденовой сини (смеси различных окислов молибдена).

В каждую пробирку с безбелковым фильтратом добавляют по 1 мл 2,5% раствора молибденовокислого аммония в серной кислоте и по 0,5 мл 0,5% раствора аскорбиновой кислоты, перемешивают и оставляют на 15 минут. Затем в каждую пробирку добавляют по 8 мл дистиллированной воды и перемешивают.

Интенсивность синей окраски уменьшается от первой пробирки к последней, что связано с уменьшением неорганического фосфата в процессе брожения.

Указания к составлению отчета: Написать реакцию спиртового брожения, в которой расходуется неорганический фосфат.