Лабораторная работа № 2

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

Цель работы – научиться количественно определять активность амилазы слюны по Вольгемуту.

Об активности фермента судят по количеству субстрата, изменяющегося под влиянием фермента в единицу времени, за изменением субстрата в присутствии фермента можно следить по появлению в растворе тех или иных продуктов реакции.

Метод количественного определения активности амилазы слюны по Вольгемуту заключается в том, что слюну разводят в определенной последовательности, после чего одно и то же количество крахмала приливают, определяют наименьшее содержание фермента, которое полностью расщепляет все количество добавленного крахмала, затем производят расчет на 1 мл слюны.

Амилазная активность слюны в данной работе выражается количеством 1% раствора крахмала в мл, которое может расщепить 1 мл слюны при температуре 37С в течение 30 мин.

Исследуемый материал: слюна, разведенная водой в 10 раз.

Реактивы: 0,5% раствор крахмала; 0,1% раствор I₂; вода дистиллированная.

Оборудование: штатив с пробирками, пипетки.

Ход работы. В 10 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл воды. В 1-ю добавляют 1 мл слюны, разведенной в 10 раз, перемешивают несколько раз, втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси из одной пробирки, переносят ее во 2-ю; из 2-й таким же образом в 3-ю и т.д. до 10-й пробирки, из 10-й пробирки 1 мл смеси выливают. В каждой последующей пробирке, таким образом, содержание фермента вдвое меньше, чем в предыдущей.

Во все 10 пробирок приливают по 1 мл воды и по 2 мл 0,1% раствора крахмала. Перемешивают, встряхивают пробирки и помещают в термостат при температуре 37С на 30 мин. Через 30 мин пробирки вынимают, охлаждают их водопроводной водой, во все добавляют по 1 капле раствора йода, перемешивают и отмечают окраску.

Указания к составлению отчета.

Данные занести в таблицу 2.

Таблица 2

Определение амилазной активности слюны

№ про-бир-ки	Разведение слюны	Количество крахмала, мл	Температура реакции	Время реакции	Окраши-вание йодом	Актив-ность амилазы
1	1:10
2	1:20
3	1:40
4	1:80
5	1:160
6	1:320
7	1:640
8	1:1280
9	1:2560
10	1:5120

Активность амилазы определяют по формуле:

Х = 2 х А,

где Х – активность амилазы в расчете на 1 мл слюны;

А – разведение слюны в последней пробирке с желтоватой окраской.