- •Биохимия Методические указания к лабораторным работам для студентов очной формы обучения по специальности 070100 – «Биотехнология»
- •Составители: л.В. Аникина, л.С. Пан, г.А. Козлова
- •Введение
- •Техника безопасности при работе в биохимической лаборатории
- •Порядок работы в лаборатории
- •Оформление лабораторной работы
- •Раздел I. Ферменты Лабораторная работа №1
- •Лабораторная работа № 2
- •Лабораторная работа №3
- •1. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.
- •2. Специфичность действия амилазы и сахаразы.
- •3. Активаторы и ингибиторы α-амилазы слюны.
- •4. Определение оптимума рН активности амилазы
- •Раздел II. Витамины Лабораторная работа №4
- •5. Обнаружение рибофлавина (витамина в2).
- •6. Качественная реакция на никотинамид (витамин рр).
- •7. Качественная реакция на пиридоксин (витамин в6).
- •8. Качественная реакция на аскорбиновую кислоту (витамин с).
- •9. Качественная реакция на рутин (витамин р).
- •Лабораторная работа №5
- •Лабораторная работа №6
- •Лабораторная работа №7
- •Лабораторная работа №8
- •Раздел III. Обмен веществ Лабораторная работа №9
- •Лабораторная работа №10
- •Лабораторная работа №11
- •1. Построение калибровочного графика
- •2. Определение фосфора в культуральной жидкости
- •Лабораторная работа №12 качественные реакции на некоторые составные части молока
- •Литература
Лабораторная работа №10
ОРТОТОЛУИДИНОВЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ В КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ
Цель работы – ознакомиться с одним из распространенных методов количественного определения основного показателя углеводного обмена - глюкозы.
Глюкоза при нагревании с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты дает сине-зеленое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы и определяется на фотоэлектроколориметре.
Исследуемые материалы: культуральная жидкость.
Реактивы: 3% раствор трихлоруксусной кислоты; ортотолуидиновый реактив (0,15 г тиомочевины растворяют в 94 мл ледяной уксусной кислоты и смешивают с 6 мл перегнанного ортотолуидина; хранят в темной склянке); стандартный 0,1% раствор глюкозы.
Оборудование: фотоэлектроколориметр; центрифуга; центрифужные пробирки; штатив с пробирками, водяная баня, пипетки.
Ход работы.
а) Осаждение белков. В две центрифужные пробирки наливают по 0,9 мл 3%-го раствора трихлоруксусной кислоты, затем в одну из них вносят 0,1 мл культуральной жидкости, а в другую - 0,1 мл стандартного раствора глюкозы. Содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.
б) Цветная реакция с ортотолуидиновым реактивом. 0,5 мл надосадочной жидкости из каждой пробирки вносят в обычные сухие пробирки, добавляют по 4,5 мл ортотолуидинового реактива и помещают в кипящую водяную баню (100оС) на 8 минут (время инкубации проб и температурный режим необходимо соблюдать точно, кроме того, обязательным условием для нормального протекания данной реакции является непрерывное кипение воды в бане). По истечении времени пробирки вынимают и охлаждают в водопроводной воде до комнатной температуры.
в) Измерение оптической плотности растворов. Оптическую плотность проб измеряют на фотоэлектроколориметре в кюветах на 10 мм против воды с красным светофильтром (620 нм).
Указания к составлению отчета.
Содержание глюкозы в опытной пробе рассчитывают по стандартному раствору глюкозы по формуле:
Соп = (Сст . Еоп) / Ест,
где Cоп - концентрация глюкозы в пробе, ммоль/л,
Cст - концентрация глюкозы в стандартной пробе, 5,55 ммоль/л,
Еоп. - оптическая плотность исследуемой пробы,
Ест - оптическая плотность стандартного раствора глюкозы.
Лабораторная работа №11
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕОРГАНИЧЕСКОГО ФОСФОРА В КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ
Цель работы – ознакомиться с колориметрическим методом определения неорганического фосфора в культуральной жидкости.
Неорганический фосфор биологических жидкостей входит в состав солей фосфорной кислоты. Основное назначение солей фосфорной кислоты в биологических жидкостях - создание в них буферной системы. Неорганический фосфат взаимодействует с молибдатом аммония в присутствии восстановителей (например, аскорбиновой кислоты) с образованием окрашенного комплексного соединения (молибденовой сини). Интенсивность окраски раствора пропорциональна концентрации неорганического фосфата.
Исследуемые материалы: культуральная жидкость.
Реактивы: 10% раствор трихлоруксусной кислоты; молибденовый реактив (см. работу №9); 1% раствор аскорбиновой кислоты на 0,1 М растворе соляной кислоты; дигидрофосфат калия (навеску 0,4394 г КН2РО4, предварительно высушенного в эксикаторе над серной кислотой, взвешивают на аналитических весах и растворяют в колбе вместимостью 100 мл; затем этот раствор разводят в 100 раз и используют для построения калибровочного графика).
Оборудование: фотоэлектроколориметр; центрифуга; центрифужные пробирки; штатив с пробирками, пипетки.
Ход работы.