Тема 4. Будова прокаріотичної клітини. Поверхневі структури прокаріотів

Запитання для обговорення

1. Відмінності в організації та функціонуванні прокаріотичної та еукаріотичної клітин.

2. Клітинна стінка грампозитивних та грамнегативних бактерій. Метод Грама.

3. Цитоплазматична мембрана та її функції.

4. Капсула, слизові чохли.

5. Джгутики, пілі, простеки, шипи.

Самостійна робота

1. Приготування на одному склі мазків із культур Staphylococcus aureus, Escherichia coli та їх суміші. Засвоєння методу фарбування за Грамом.

2. Мікроскопічне дослідження готових препаратів різних структур бактеріальної клітини: капсули, клітинної стінки, джгутиків.

3. Вивчення рухливості бактерій за допомогою приготування препаратів “роздавлена крапля”, “висяча крапля”.

Методичні вказівки

1. У ході виконання даної роботи на одному склі потрібно приготувати всі три мазки на відстані приблизно1 см один від одного та одночасно забарвити їх за методом Грама.

Слід зазначити, що метод є найбільш універсальним із усіх складних способів фарбування. Він має важливе діагностичне значення, бо є одним із критеріїв установлення виду бактерій. Усі бактерії за цим методом розподіляють на дві групи: грампозитивні та грамнегативні. Грампозитивні утримують комплекс генціанового фіолетового з йодом під час обробки препарату спиртом, і тому забарвлюються в синьо-фіолетовий колір. Грамнегативні бактерії не мають такої здатності й знебарвлюються спиртом. У процесі наступної обробки фуксином чи сафраніном вони набувають рожево-червоного кольору.

Для засвоєння фарбування за Грамом, на одному знежиреному предметному склі роблять мазки різних мікроорганізмів: у центрі – мазок суміші грампозитивних і грамнегативних бактерій, по краях – контрольних культур. Клітини однієї контрольної культури повинні бути грампозитивними (наприклад, Staphylococcus aureus), другої – грамнегативними (наприклад, Escherichia coli). Мазки слід робити тонкими, щоб клітини рівномірно розподілялись на поверхні скла й не утворювали скупчень. Препарати висушують на повітрі, фіксують над полум’ям пальника та фарбують упродовж 1 – 2 хв карболовим генціановим чи кристалічним фіолетовим. Потім фарбу зливають і, не промиваючи мазок водою, обробляють його 1-2 хв розчином Люголя до почорніння. Зливають розчин Люголя, знебарвлюють 0,5 – 1,0 хв 90°-им етиловим спиртом, струшуючи, швидко промивають водою та додатково фарбують 1-2 хв водним фуксином. Барвник зливають, препарат промивають водою, висушують і мікроскопують із імерсійною системою. У разі правильного забарвлення грампозитивні бактерії (S. aureus) мають синьо-фіолетовий колір, а грамнегативні (E. coli) – рожево-червоний колір. За Грамом фарбують клітини молодих (18 – 24 годинних) культур, тому що здатність утримувати барвник залежить від фізіологічного стану бактерій.

2. Деякі види бактерій виробляють слизову речовину, яка концентруючись навколо тіла мікробної клітини, утворює капсулу. У разі звичайних методів фарбування капсула залишається безбарвною. Для виявлення капсул застосовують спеціальні методи фарбування (наприклад Бурі-Гінса). Студенти мікроскопують препарат Bacillus anthracoides, приготований за методом Бурі-Гінса. Звертають увагу на безбарвну капсулу навколо тіла бактеріальної клітини, яке забарвлене в червоно-рожевий колір фуксином. Темний фон, на якому видно клітини, створюється за рахунок туші.

3. Метод вивчення мікробів у живому незафарбованому стані має таку перевагу, що ми можемо спостерігати в них різноманітні процеси: рухливість, ріст, ділення, спороутворення, проростання спор.

Для цього готують препарати “роздавленої” та “висячої краплі”.

“Роздавлена крапля”: на предметне скло наносять піпеткою краплю культури й накривають її склом. Бажано, щоб при цьому не утворювалися бульбашки повітря, які заважають вивченню препарату під мікроскопом.

“Висяча крапля”: використовують спеціальне скло з луночкою, покривне скло, вазелін. Край луночки вкривають невеликим шаром вазеліну. На накривне скло наносять краплю бульйонної культури, потім обережно склом із луночкою накривають скло так, щоб крапля опинилась у центрі. Виходить герметично закрита камера. Предметне скло швидко перевертають уверх накривним склом. Крапля повинна вільно звисати в заглиблення, не торкаючись його дна та країв.

Для вивчення мікроорганізмів у живому стані використовують сухі системи (об’єктиви зі збільшенням у 8 і 40 разів), увігнуте дзеркало, трохи опущений конденсор і злегка прикриту діафрагму.

Рухливість у більшості мікроорганізмів обумовлена наявністю джгутиків. Їх розташування та кількість у різних бактерій неоднакова й має діагностичне значення, особливо під час ідентифікації паличкоподібних грамнегативних бактерій. За характером руху бактерій у препараті можна визначити тип джгутикування. Якщо джгутики розміщені на одному чи двох полюсах клітини, то рухаються вони дуже швидко, наче угвинчуються, без коливань із боку в бік; під час латерального чи перитрихіального розташування джгутики клітини рухаються плавно, здійснюючи коливання відносно осі руху. Окремий бактеріальний джгутик настільки тонкий, що його не можна побачити у світловому мікроскопі, якщо його не пофарбувати за спеціальним методом, який дозволяє збільшити видиму товщину джгутика. Так, діаметр окремих джгутиків коливається від 0,01 до 0,02 мкм (у Bdellovibrio – 0,04 – 0,06 мкм), а найбільша роздільна відстань світлового мікроскопа – 0,2 мкм. Лише в деяких бактерій, наприклад, у представників Spirillum, пучки джгутиків можна виявити під час спостереження на світловому полі за допомогою фазового контрасту чи на темному полі.

Матеріали, обладнання, реактиви

Живі культури, Staphylococcus aureus, E. coli, барвники та реактиви для фарбування за Грамом (генціановий фіолетовий, розчин Люголя, 96°-ний етанол, фуксин), предметні скельця, фільтрувальний папір, бактеріологічна петля, фізіологічний розчин, предметне скельце з луночкою, накривне скло, вазелін, імерсійна олія, мікроскоп МБІ-1, готові пофарбовані препарати різних поверхневих структур бактеріальної клітини: капсули, клітинної стінки, джгутиків.