Тема 9. Поширення мікроорганізмів у природі та їх роль у кругообігу речовин

Запитання для обговорення

1. Розповсюдження мікроорганізмів у природі. Мікрофлора повітря, води, ґрунту.

2. Участь мікроорганізмів у кругообігу вуглецю та кисню.

3. Етапи перетворення азотвмісних сполук різними групами бактерій.

4. Кругообіг фосфору, заліза, сірки.

Самостійна робота

1. Визначення ферментативної активності досліджуваних мікроорганізмів (облік кольорових рядів, визначення індолу, сірководню, аміаку, гемолізу еритроцитів).

2. Вивчення представників ґрунтових бактерій різних фізіологічних груп.

3. Визначення загальної кількості бактерій у воді.

4. Дослідження мікрофлори повітря.

Методичні вказівки

1. Визначити наявність і ступінь розщеплення вуглеводів різними видами бактерій за схемою:

Вид бактерій	Лактоза	Глюкоза	Маніт	Сахароза	Молоко
Стафілокок	К	К	К	–	Утворення згустку
Кишкова паличка	КГ	КГ	КГ	–	Утворення осаду та пептонізація

Визначаючи метаболічні особливості бактерій на цукрових середовищах, звернути увагу на зміну їх кольору. Звичайно, у разі нейтральної чи слабколужної реакції середовища індикатор має ледь рожевий відтінок. Якщо досліджуваний мікроорганізм виділяє фермент, що розщеплює вуглевод, то в результаті утворюються проміжні кислі продукти, які змінюють реакцію середовища. Індикатор у кислому середовищі змінює свій колір: він стає зелено-блакитним. Ступінь розщеплення вуглеводів може бути різним. Якщо розщеплення відбувається до кінцевих продуктів СО₂ та Н₂О, то окрім зміни кольору індикатору, в товщі середовища зיявляються бульбашки газу. У разі вирощування на молоці мікроби можуть викликати утворення осаду та пептонізацію.

Вивчаючи кінцеві продукти розщеплення білків гнилісними бактеріями B. subtilis та E. coli, засіяними на м’ясо-пептонному бульйоні, необхідно звернути увагу на зміну кольору індикаторних папірців.

У разі утворення сірководню чорніє індикаторний папірець, заздалегідь змочений гарячим насиченим розчином щавелевої кислоти (метод Мореля).

Аміак визначають за посинінням рожевого лакмусового папірця. Результати визначення кінцевих продуктів розщеплення пептону заносять у протокол.

Гемолітичну активність мікроорганізмів визначають за утворенням прозорої зони навколо колоній мікроорганізмів на кровיяному агарі.

У разі наявності росту культури грамнегативних паличок, звертають увагу на колір колоній, а також на наявність металевого блиску; яскраво-малинові колонії з металевим блиском характерним для культур E. coli.

2. Для вивчення ґрунтових бактерій важливо правильно зробити відбір зразка. Інструменти для відбору проб вичищають, дезінфікують спиртом і обпалюють у вогні. Стерильним інструментом знімають поверхневий шар землі (2 см), після чого стерильним совком відбирають ґрунт у стерильний посуд. Мікробіологічний аналіз проводять не пізніше 24 год після відбору проб. Ґрунтову витяжку готують на стерильній водопровідній воді (1 г ґрунту на 100 мл води), ретельно перемішують протягом 5 хв, дають відстоятись до осідання великих часток.

Із отриманої витяжки готують ряд препаратів – “роздавлена крапля”, “висяча крапля”, фіксований мазок, забарвлений за Грамом. Мікроскопують, результати заносять до протоколу заняття.

3. Визначення загальної кількості бактерій у воді. Проби води відбирають у стерильний посуд (пробірки). Готують розведення проб у 10, 100 та 1000 разів стерильною водою, проби водопровідної води досліджують не розбавляючи. Стерильними піпетками вносять по 1 мл досліджуваних проб до стерильних чашок Петрі, заливають у чашки розплавлене й охолоджене до 45°С середовище (МПА). Похитують чашки для рівномірного перемішування проби та середовища, при цьому уникаючи утворення повітряних бульбашок. Роблять на чашках необхідні позначки (№ проби, розведення) та після застигання середовища поміщають чашки до термостата. Культивують при температурі 37°С протягом доби. Враховують результат, підраховуючи колонії як на поверхні, так і в товщі середовища.

Визначають кількість мікроорганізмів у 1 мл води з урахуванням розведень. Залежно від кількості мікроорганізмів у 1 мл води можна визначити ступінь забруднення води. Результати заносять до таблиці.

Ступінь забруднення води

Характеристика води	Кількість мікроорганізмів в 1 мл	Результат досліду
Дуже чиста	N × 10
Чиста	N × 10^2
Помірно забруднена	N × 10^3
Забруднена	N × 10^4
Брудна	N × 10^5
Дуже брудна	N × 10^6

Примітка: N – число від 1 до 9.

4. Дослідження мікрофлори повітря. Повітря є найменш сприятливим середовищем для життя мікроорганізмів. Це зумовлено рядом факторів: відсутністю поживних речовин, достатньої кількості вологи, впливом сонячного випромінювання тощо. Мікроорганізми потрапляють у повітря з пиловими частинками, мікрокраплинами води тощо.

Найбільш простим доступним методом дослідження мікрофлори повітря є седиментаційний метод (за Р. Кохом). У приміщенні, де проводять дослідження розставляють чашки Петрі з середовищем (МПА), відкривають на 5 – 10 хв. Закривають, роблять позначки та вміщують до термостату при температурі 28 – 30°С на дві доби. Враховують результати й проводять такі розрахунки: визначають площу поверхні  поживного середовища чашки Петрі за формулою S= πr²; перераховують кількість колоній, що виросли на чашці площею 100 см². Доцільність такого перерахунку полягає в тому, що як вважається на площу 100 см² за 5 хв осідають усі клітини та спори мікроорганізмів, що містяться в 10 л повітря, кількість мікроорганізмів на 1м³ (1000 л) повітря приміщення. Далі визначають виділені мікроорганізми. Найчастіше в повітрі виявляються Micrococcus albus, M. roseгs, Sarcina flava, Bacillus subtilis, B. cereus, B. megaterium, цвілеві гриби – p. Mucor, p. Penicillium, p. Aspergillus тощо. Можуть виділятися з повітря і умовно-патогенні та патогенні бактерії (стафілококи, стрептококи тощо. ).

Матеріали, обладнання, реактиви

Мікроскоп МБІ-1, імерсійна олія, фільтрувальний папір, предметні скельця, бактеріологічна петля, фізіологічний розчин, дистильована вода, барвники за Грамом, проба ґрунту, проби води, чашки Петрі з МПА, стерильні пробірки та піпетки.