Тема 6. Фізіологія мікроорганізмів. Особливості живлення бактерій.

Запитання для обговорення

1. Способи існування прокаріотів: джерела енергії, донори та акцептори, джерела вуглецю.

2. Типи живлення мікроорганізмів, харчові потреби, фактори росту.

3. Механізм надходження поживних речовин у бактеріальну клітину.

4. Методи виділення чистих культур аеробних бактерій.

Самостійна робота

1. Приготування живильних середовищ (МПА).

2. Освоєння техніки пересіву чистих культур на рідкі та тверді живильні середовища. Посів виснажуючим штрихом, газоном, уколом, посів на сектори.

3. Приготування мазків із суміші двох видів бактерій, забарвлення за Грамом, мікроскопія. Посів суміші культур методом виснажуючого штриха на чашку з МПА з метою отримання окремих колоній.

Методичні вказівки

1. Живлення є важливою функцією мікроорганізмів, необхідною для їх росту та розмноження. Для культивування бактерій застосовують різні поживні середовища, які повинні мати в своєму складі всі необхідні поживні речовини, фактори росту, певну реакцію рН та бути обов’язково стерильними.

Студенти знайомляться з різними поживними середовищами, які можна класифікувати за складом на дві групи.

А. Натуральні середовища, що складаються з продуктів рослинного та тваринного походження. Це овочеві та фруктові соки, молоко, кінська сироватка, що зсілась, шматочки картоплі та моркви, приготовані в пробірках відвари, екстракти, одержані з природних субстратів.

До натуральних середовищ невизначеного складу належать м’ясо-пептонний агар, пептонний бульйон, дріжджове та картопляне середовища, ґрунтова витяжка, а також напівсинтетичні середовища: МПБ із 2%-им розчином глюкози, дріжджевий автолізат і солі амонію та вуглеводи в певній кількості.

Б. Синтетичні середовища, до складу яких входять тільки певні хімічно чисті сполуки, в точно вказаних концентраціях: середовище Виноградського для нітрифікуючих бактерій.

За призначенням розрізняють: селективні середовища, які забезпечують переважаючий розвиток одного виду чи групи мікроорганізмів – це середовище Чапека (для актиноміцетів), Врублевського, Кітта-Тароцці (для анаеробів), МПА з новобіоцином (для сапрофітних стафілококів, стійких до новобіоцину) та диференційно-діагностичні (індикаторні) середовища, які дозволяють достатньо відрізнити одні види мікроорганізмів від інших – це середовище Ендо (для кишкових бактерій), вуглеводні середовища, до складу яких входять різні вуглеводи з індикатором.

За фізичним станом середовища поділяють на рідкі (МПБ), тверді (МПА) та сипучі (розварене пшоно, висівки).

2. Студенти засвоюють правила роботи з чистими культурами мікроорганізмів, методи культивування.

Викладач ознайомлює студентів із основними мікробіологічними термінами: посів чи інокуляція – внесення клітин мікроорганізмів у стерильне середовище; поняттями: чиста культура, штам, клон; із основним посудом, що використовується для вирощування мікроорганізмів на твердих та рідких середовищах (чашки Петрі, колби тощо).

Студенти під контролем викладача засвоюють техніку пересіву чистих культур на тверді та рідкі поживні середовища.

Для посіву чи приготування препаратів клітини мікроорганізмів беруть бактеріологічною петлею, якщо культура вирощена на твердому поживному середовищі, та використовують стерильні піпетки для вирощування мікроорганізмів у рідкому середовищі.

Пробірку з культурою беруть у ліву руку так, щоб поверхня живильного середовища з нальотом мікроорганізмів була повернена догори й трохи нахилена. У праву руку беруть петлю, прожарюють у полум’ї пальника. Потім, не випускаючи петлі, мізинцем та безіменним пальцем правої руки притискають зовнішній кінець ватяної пробки до долоні й виймають пробку з пробірки.

Краї відкритої пробірки прожарюють у полумיї пальника, вводять у пробірку стерильну петлю та, відібравши невелику кількість мікробної маси, обпаляюють внутрішній кінець ватяної пробки й закривають нею пробірку. Відібраний матеріал використовують для приготування препарату чи пересіву на свіже середовище. Клітини мікроорганізмів, які залишаються на петлі, спалюють.

Клітини мікроорганізмів, які виросли на рідкому середовищі, збирають стерильною піпеткою, рідко – петлею. Для цього піпетку виймають із паперу, в якому вона стерилізувалась, тримаючи за верхній кінець середнім та великим пальцями правої руки. У ліву руку беруть пробірку (колбу) з рідким середовищем, відкривають, як описано вище, та вводять у неї піпетку. Відібравши частину середовища, закривають пробірку (колбу) й використовують взяту пробу для приготування препарату чи посіву на свіже поживне середовище. Після цього піпетку негайно занурюють у дезінфікуючий розчин (0,5-3%-ий водяний розчин хлораміну чи 3-5%-ий водяний розчин фенолу), не торкаючись нею навколишніх предметів.

Пересіваючи клітини мікроорганізмів із одного середовища на інше, в ліву руку зручно взяти дві пробірки: одну зі стерильним середовищем (далі від себе), іншу – з культурою мікроорганізмів (ближче до себе), а в праву руку – бактеріологічну петлю. Стерилізують петлю в полум’ї пальника, потім, притиснувши пробки двох пробірок до долоні мізинцем та безіменним пальцями правої руки, відкривають пробірки. Бактеріологічною петлею відбирають клітини мікроорганізмів і вводять петлю в пробірку зі стерильним скошеним агаром майже до дна. Ледь торкаючись петлею поверхні агару, проводять знизу вгори зигзагоподібну чи пряму лінію – штрих. Посів голкою проводять у такій же послідовності, як і посів петлею, з тією лише різницею, що в товщу агаризованого середовища роблять укол.

Якщо посів проводять у рідке середовище, то пробірки тримають майже вертикально, щоб не замочити пробки. Петлю з мікроорганізмами занурюють безпосередньо в середовище.

Усі описані вище маніпуляції здійснюють біля полум’я пальника якнайшвидше, щоб не забруднити культуру сторонніми мікроорганізмами.

Студенти самостійно проводять пересіви чистих культур бактерій на скошений агар. Необхідно слідкувати за тим, щоб під час цього петля не пошкоджувала поверхню середовища. Результати пересівів переглядають на наступному занятті.

3. Кожен студент одержує під відповідним номером заздалегідь приготовану суміш із двох видів бактерій. Із суміші готують мазок, забарвлюють за Грамом і розглядають під мікроскопом.

Якщо препарат приготований правильно, в кожній суміші виявляються бактерії двох видів, наприклад, стафілокок (Гр+) і кишкова паличка (Гр-), сінна паличка (Гр+) і вібріон (Гр-), тобто один із них забарвлюється за Грамом позитивно, інший – негативно. Потім суміш бактерій за допомогою петлі розсівається по поверхні мיясо-пептонного агару, завчасно розлитого в чашки Петрі. На петлю необхідно брати трохи матеріалу, її вушко не повинне бути заповнене рідиною. Посів проводять паралельними штрихами по всій поверхні середовища на відстані 0,5 см між ними. Чашки підписують і вміщують у термостат.

Матеріали, обладнання, реактиви

Культури: суміш культур Гр+ і Гр- мікроорганізмів; бактеріологічна петля, чашки з МПА, пробірки з МПБ, агарові стовпчики, предметні скельця, мікроскоп МБІ-1, імерсійна олія, фільтрувальний папір, дистильована вода, фарби.