Тема 1. Знайомство з мікробіологічною лабораторією. Мікроскопічні методи дослідження

Запитання для обговорення

1. Мікробіологічна лабораторія та основні особливості роботи в ній.

2. Основні типи мікроскопів. Будова оптичного мікроскопа. Імерсійна мікроскопія.

3. Положення мікроорганізмів у природі.

Самостійна робота

1. Приготування препаратів із культур стафілококів, кишкової палички, сінної палички.

2. Мікроскопічне дослідження виготовлених препаратів за допомогою імерсійної системи.

3. Зобразити переглянуті препарати.

Методичні вказівки

1. До складу мікробіологічної лабораторії входять лабораторні кімнати для мікробіологічних досліджень, автоклавна (або стерилізаційна) для знезаражування відпрацьованого матеріалу й використаного посуду; кімната моєчна для миття посуду; кімната для приготування поживних середовищ, віварій для лабораторних тварин; матеріальна для збереження запасних реактивів, посуду, апаратури; бокс із передбоксником для виконання роботи в асептичних умовах. Приміщення мікробіологічної лабораторії повинні бути зручними для вологого прибирання та оброблятись дезінфекційними засобами. Також вони мають бути оснащені бактерицидними лампами. Велике значення має правильна організація робочого місця бактеріолога та лаборанта, яке повинно бути обладнане необхідними для мікробіологічних дослідів предметами.

2. Для вивчення морфології мікроорганізмів використовують оптичні мікроскопи. Світлопільні мікроскопи дозволяють досліджувати об’єкти в проникаючому світлі.

Викладач нагадує студентам будову оптичного мікроскопа МБІ-1, МБР. Механічна частина мікроскопа включає штатив із предметним столиком і тубус. Оптична частина мікроскопа складається з освітлювального апарата (конденсор і дзеркало), об’єктива та окуляра. Загальне збільшення, яке дає мікроскоп, обчислюється добутком збільшення об’єктива та збільшення окуляра.

Чіткість одержуваного зображення характеризується роздільною здатністю мікроскопа, яка визначається мінімальною роздільною відстанню між двома точками, коли вони ще не зливаються в одну. Роздільна відстань залежить від довжини хвилі, використаного в процесі мікроскопування світла та кількості променів, що потрапляють на лінзу об’єктива, та виражається формулою:

,

де d – мінімальна відстань між двома точками; λ – довжина хвилі використаного світла; А₁ – числова апертура об’єктива; А₂ – числова апертура конденсора.

Числова апертура (“обхват лінзи”) обчислюється за формулою:

,

де U – половина отвірного кута променів, що входять у об’єктив; n – показник заломлення середовища, яке межує з лінзою.

Роздільна здатність мікроскопа – величина обернена до роздільної відстані. Чим менша абсолютна величина, тим вища роздільна здатність мікроскопа, тим меншого розміру об’єкт можна побачити. Світловий мікроскоп при освітленні видимим світлом має роздільну здатність близько 0,2 мкм.

Роздільна здатність мікроскопа залежить від довжини хвилі світла, освітлюваного препарату (наприклад, при освітленні ультрафіолетовими променями роздільна здатність зростає), величини апертури, показника заломлення того середовища, яке знаходиться між об’єктом та лінзою об’єктива. Замінюючи повітряне середовище між лінзою об’єктива і об’єктом мікроскопічного дослідження на імерсійну речовину (імерсійна олія, вода), можна підвищити роздільну здатність, оскільки показник заломлення світла (n) для імерсійної олії, дорівнює 1,515, а для повітря – n=1,0. Окрім того, показники заломлення імерсійної олії та скла (n=1,52) майже однакові, що зумовлює відсутність заломлення променів і потрапляння їх в об’єктив без зміни напрямку. У зв’язку з дуже малими розмірами мікроорганізмів для їх вивчення головним чином використовують імерсійні об’єктиви.

Перед початком роботи необхідно перевірити справність мікроскопа та чистоту оптики.

Настроїти освітлення: 1) підняти до упора конденсор, відкрити діафрагму, установити плоске дзеркало, 2) опустити об’єктив малого збільшення ×8 на відстань близько 0,5 см від предметного скла й повертаючи дзеркало відрегулювати освітлення таким чином, щоб усе поле зору було освітлене рівномірно та яскраво.

Після встановлення світла на сухий фіксований забарвлений препарат (демонстраційний) наносять краплю імерсійної олії. Установлюють об’єктив ×90 та, дивлячись збоку, обережно опускають макрометричним гвинтом тубус мікроскопа до занурення об’єктива в олію. Слідкують за тим, щоб фронтальна лінза об’єктива не торкнулась предметного скла, не пошкодила і не роздавила його. Потім, спостерігаючи в окуляр, макрогвинтом повільно підіймають тубус і фокусують об’єкт. Тонке фокусування здійснюють за допомогою мікрометричного гвинта.

Після роботи кедрову олію швидко знімають із об’єктива та конденсора клаптиком фільтрувального паперу, а потім витирають ватним чи марлевим тампоном, змоченим очищеним бензином.

3. Дослідження морфології мікробів у забарвленому стані є найбільш розповсюдженим у мікробіології методом. Фіксовані забарвлені препарати використовуються також для кількісного обліку мікроорганізмів, перевірки чистоти культури. Ці препарати вигідні тим, що можуть зберігатися довгий час.

Фіксовані зафарбовані препарати розглядають за допомогою імерсійного обיєктива. Етапи їх приготування:

а) приготування мазка. Для приготування мазка з агаризованої культури на середину чистого предметного скла наносять прожареною над вогнем петлею, краплю фізіологічного розчину, а потім петлею з пробірки ‑ трохи матеріалу, занурюють його в краплину, розтирають і рівномірно розподіляють по склу в розмірі приблизно на 1 см. Мазок повинен бути тонким. Викладач демонструє техніку приготування мазків із рідкої культури, патологічного матеріалу, крові;

б) висушування. Препарати висушують при кімнатній температурі на повітрі. Для прискорення цього процесу препарат можна підігріти теплим повітря високо над полум’ям пальника, тримаючи скло мазком догори;

в) фіксація. Фіксація дозволяє вбити мікроби, забезпечити краще прилипання мазка до скла, зробити мазок більш чутливим до фарбування. Для фіксації сухий препарат декілька разів проводять через полум’я пальника. Швидкість і кратність проведення препарату через полум’я регулюється відчуттям опіку на пальцях. Не можна перегрівати препарат, так як порушується структура клітин.

У ряді випадків фіксація прогріванням виявляється дуже грубою (у разі вивчення внутрішньої структури бактеріальної клітини, мазків із крові та інших матеріалів, які мають тваринні клітини). Тоді препарат фіксують різними фіксаторами: етиловим, метиловим спиртами, розчином Никифорова тощо.

г) фарбування. Клітини мікроорганізмів фарбують головним чином аніліновими барвниками. Розрізняють кислі барвники (еозин, кислий фуксин), які інтенсивно зв’язуються з цитоплазматичними (основними) компонентами клітини та основні – метиленовий синій, основний фуксин, генціановий фіолетовий тощо, які більш інтенсивно зв’язуються з ядерними (кислими) компонентами клітини. У ході дослідження мікроорганізмів використовуються майже всі основні барвники, оскільки бактерії щодо барвників поводять себе так, начебто вони складаються в основному з нуклеїнової кислоти, яка реагує з основними барвниками, що забезпечує забарвлення клітин.

Розрізняють прості та диференційні способи фарбування мікроорганізмів. Під час простого фарбування забарвлюється вся клітина, отже, стають добре видимими її форма та розміри.

Фіксовані препарати кладуть на дві паралельні, з’єднані резиновими трубками, скляні палички, які вміщені на бортах кювети, вкривають розчином одного з барвників (метиленовою синькою чи водним розчином фуксину), який залишають на 2 – 5 хвилин. Потім препарат промивають, висушують за допомогою фільтрувального паперу. На сухий препарат (пофарбований) наносять краплю імерсійної олії і вивчають за допомогою імерсійного об’єктива.

Кожен студент готує препарати з агаризованих культур Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, фарбує його й проводить мікроскопічне дослідження в імерсійній системі.

Переглядаючи препарати, слід звернути увагу на форму, розміри та розміщення клітин мікроорганізмів. рисунок препаратів роблять кольоровим олівцем із підписом мікроорганізму латинською мовою.

Матеріали, обладнання, реактиви

Культури: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, готові забарвлені препарати, мікробіологічна петля, фільтрувальний папір, мікроскоп МБІ – 1, імерсійна олія, предметне скло, бензин, фарби – кислий фуксин, метиленова синька, дистильована вода.