- •Реферат
- •Введение
- •Обзор и анализ научно технической и патентной информации.
- •Нейтрофины.
- •Общая характеристика.
- •1.2 Нейротрофины в цнс
- •2. Рецепторы нейтрофинов.
- •2.1Высокоаффинный рецептор к нейротрофинам pl40 prototrk
- •2.2 Низкоаффинный рецептор к нейротрофинам p75lntr.
- •Фактор роста нервов.
- •История открытия
- •3.2 Молекулярная характеристика.
- •Третичная структура.
- •3.4 Механизм взаимодействия ngf с рецепторами.
- •3.5 Захват и ретроградный транспорт ngf.
- •3.6 Функции ngf в организме.
- •3.6.1 Действие ngf на нервные клетки.
- •3.6.2 Значение ngf в метаболизме.
- •3.6.3 Участие ngf в патологических состояниях.
- •4. Современные достижения в получении рекомбинантного ngf для фармацевтической индустрии.
- •5 Экспрессия рекомбинантных генов.
- •5.1 Вводная часть.
- •5.2 Конструирование экспрессионных векторов и их функционирование.
- •5.3 Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов.
- •6 Выводы по разделу
- •Основная часть
- •1. Материалы, методы и оборудование
- •1.1 Оборудование
- •1.2 Программное обеспечение
- •1.3 Лабораторные посуда и расходные материалы.
- •1.4 Штаммы e.Coli
- •1.5 Среды для выращивания бактерий
- •1.6 Препараты днк
- •1.7 Ферменты
- •1.7 Реактивы и наборы реактивов
- •Приготовление рвs буфера (х10):
- •10% Уксусная кислота
- •1.9.1 Рестрикция
- •1.9.2 Электрофоретичское разделение днк в агарозном геле.
- •1.9.3 Выделение днк из агарозного геля.
- •1.9.4. Полимеразная цепная реакция (пцр).
- •1.9.5 Лигирование.
- •1.9.6 Pipes трансформация клеток e. Coli плазмидной днк
- •1.9.7 Культивирование, выделение и очистка плазмидной днк из клеток e. Coli
- •1.9.8 Проведение пцр-скрининга.
- •1.9.9 Секвенированиеплазмидной днк.
- •1.9.10 Быстрая трансформация.
- •1.9.11 Анализ экспрессии целевого гена.
- •1.9.12 Выделение суммарного (общего) белка из клеток e. Сoli.
- •1.9.14 Фракционирование белков из клеток e. Сoli.
- •1.9.15 Денатурирующий белковый электрофорез в sds-пааг.
- •1.9.16 Отмывка телец включения
- •1.9.17 Растворение телец включения
- •1.9.18 Выделение SumoNgf при помощи металло-хелат-аффинной хроматографии
- •1.9.19 Рефолдинг белка
- •1.9.20 Расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2. Экспериментальные исследования
- •2.1 Получение векторных конструкций.
- •2.1.1 Сборка гена ngf методом пцр.
- •2.1.2 Получение векторной конструкции pTngf
- •2.1.3 Получение гибридной последовательности SumoNgf.
- •2.1.4 Получение векторной конструкции pTSumoNgf.
- •2.2 Биосинтез целевого и гибридного белка. Подбор условий культивирования.
- •2.2.1 Биосинтез белка ngf.
- •2.2.1 Биосинтез гибридного белка SumoNgf.
- •2.3 Выделение и очистка рекомбинантного фактора роста нервов человека.
- •2.3.1 Отмывка и растворение телец включения
- •2.3.2 Металло-хелатная аффинная хроматография
- •2.3.3 Масс-спектрометрия гибридного белка ngf
- •2.3.4 Рефолдинг гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Ферментативное расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Очистка ngf на катионобменной хроматографии.
- •2.3.5 Разработка обобщённой схемы производства рекомбинантного ngf
- •Организационно – экономический раздел
- •Технико-экономическое обоснование нир
- •2. Расчёт затрат на научно-исследовательскую работу
- •2.1. Расчет материальных затрат (Cм)
- •2.2. Энергетические затраты.
- •4.2.3. Расчет затрат на заработную плату.
- •2.4. Расчет затрат на стеклянную посуду, стеклянные приборы и пластик.
- •4.2.5. Амортизационные отчисления (Сам.).
- •2.6. Накладные расходы.
- •3 Выводы по разделу
- •Безопасность жизнедеятельности
- •1 Краткая характеристика выполняемой работы.
- •2 Опасные и вредные производственные факторы на основных стадиях выполнения дипломной работы.
- •3 Перечень наиболее опасных мест на стадиях выполнения дипломной работы.
- •Основные физико-химические, токсические и пожаровзрывоопасные свойства используемых в работе веществ.
- •5 Обеспечение безопасности труда в лаборатории.
- •6 Производственная санитария.
- •6.1 Установление категории лабораторного помещения.
- •6.2 Разработка мероприятий по работе с вредными веществами.
- •6.3 Метеорологические условия.
- •6.4 Вентиляция.
- •6.5 Освещение.
- •6.7 Отопление.
- •7 Техника безопасности.
- •7.1 Электробезопасность.
- •7.2 Пожарная профилактика.
- •8. Выводы по разделу.
6 Выводы по разделу
Фактор роста нервов (англ. nerve growth factor, NGF) один из нейротрофинов, кодируемый у человека геном NGF на коротком плече 1-й хромосоме. Представляет собой небольшой секретируемый белок, определяющий развитие симпатической нервной системы, благодаря стимуляции нервных клеток.
Современные знания о данном белке позволяет его использовать при коррекции и лечение заболеваний центральной нервной системы, связанных с психическими расстройствами (слабоумие, депрессия, шизофрения, аутизм, синдром Ретта, анорексии и булимии, болезни Альцгеймера). Кроме того он играет важную роль в сердечно – сосудистых заболеваниях (атеросклероз коронарных артерий, ожирение, сахарный диабет 2 типа). Существует доказательство того, что NGF может быть полезен в лечении кожных язв и язв роговицы.
Все выше сказанное говорит о том, что создание лекарственных препаратов на основе фактора роста нервов является социально значимой проблемой. Данный белок практически невозможно выделить из природных источников. Поэтому перспективным является получение биологически активного фактора роста нервов в гетерологичных экспрессионных системах. Анализ литературы по данной проблеме показывает небольшое количество информации, что говорит об актуальности и перспективе получения рекомбинантного NGF
Основная часть
1. Материалы, методы и оборудование
1.1 Оборудование
Автоматические PCR-амплификатор Eppendorf Mastercycler personal (Германия); центрифуги Eppendorf Cenrifuge 5415C (Германия), Eppendorf Mini Spin (Германия), Jouan CR34 (Франция); ультрацентрифуга Beckman Coulter Optima L-100K (США); ультразвук MSE Soniprep 150 (Великобритания); качалки ELM Sky Line (Латвия); холодильные и морозильные камеры Bosch, Stinol (Беларусь), Atlant (Россия); кельвинатор New Brunswick Ultra Low Tempreture Freezer U 570 (США);pH-метр 440 (Аквилон, Россия); источник тока: Эльф-4 (ДНК-Технология, Россия), горизонтальная камера для электрофореза нуклеиновых кислот Helicon SE-1, (Россия); мешалки Hiedolph MR 3000, MR 3001 (c подогревом) (Германия); автоматические пипетки Gilson (Франция); электронные весы Sartorius laboratory L 610 (Германия); торсионные весы Techniprot (Польша); термостат СПУ ТС-1/20 (Россия); ламинар Gelaire Flow Laboratories Twin 30 (Италия); спектрофотометр Varian Cary 50S Scan (Австралия); водный термостат MLW UH 4 (Германия); установки для очистки воды Milli-Q EASYpureII (UV/UF ultra purewater system), REVERSINO (Werner, Германия), напольный инкубатор-шейкер CERTOMAT® BS1 (Sartoriuslaboratory, Германия), инкубатор-шейкер INNOVA® 44 (New Brunswick Scientific, США); вакуумный насос ASHCROFT (Millipore, США); набор автоматических пипеток Pipetman® P20, P100, P200, P1000 (Gilson, США); вортекс VD-6 (SkyLine ELMI, Латвия), REAX (Hiedolph, Германия), фотоаппарат PowerShot G6 (Canon, Япония),автоклав Sanyo Labo AutoclaveMLS –3751L (Япония); электронный дозатор Bio Hit Midi Plus (Финляндия); хроматограф AKTA purifier (Швеция);установка для dot-blot метода DOT®Apparatus (BIO-RAD, США).