- •Реферат
- •Введение
- •Обзор и анализ научно технической и патентной информации.
- •Нейтрофины.
- •Общая характеристика.
- •1.2 Нейротрофины в цнс
- •2. Рецепторы нейтрофинов.
- •2.1Высокоаффинный рецептор к нейротрофинам pl40 prototrk
- •2.2 Низкоаффинный рецептор к нейротрофинам p75lntr.
- •Фактор роста нервов.
- •История открытия
- •3.2 Молекулярная характеристика.
- •Третичная структура.
- •3.4 Механизм взаимодействия ngf с рецепторами.
- •3.5 Захват и ретроградный транспорт ngf.
- •3.6 Функции ngf в организме.
- •3.6.1 Действие ngf на нервные клетки.
- •3.6.2 Значение ngf в метаболизме.
- •3.6.3 Участие ngf в патологических состояниях.
- •4. Современные достижения в получении рекомбинантного ngf для фармацевтической индустрии.
- •5 Экспрессия рекомбинантных генов.
- •5.1 Вводная часть.
- •5.2 Конструирование экспрессионных векторов и их функционирование.
- •5.3 Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов.
- •6 Выводы по разделу
- •Основная часть
- •1. Материалы, методы и оборудование
- •1.1 Оборудование
- •1.2 Программное обеспечение
- •1.3 Лабораторные посуда и расходные материалы.
- •1.4 Штаммы e.Coli
- •1.5 Среды для выращивания бактерий
- •1.6 Препараты днк
- •1.7 Ферменты
- •1.7 Реактивы и наборы реактивов
- •Приготовление рвs буфера (х10):
- •10% Уксусная кислота
- •1.9.1 Рестрикция
- •1.9.2 Электрофоретичское разделение днк в агарозном геле.
- •1.9.3 Выделение днк из агарозного геля.
- •1.9.4. Полимеразная цепная реакция (пцр).
- •1.9.5 Лигирование.
- •1.9.6 Pipes трансформация клеток e. Coli плазмидной днк
- •1.9.7 Культивирование, выделение и очистка плазмидной днк из клеток e. Coli
- •1.9.8 Проведение пцр-скрининга.
- •1.9.9 Секвенированиеплазмидной днк.
- •1.9.10 Быстрая трансформация.
- •1.9.11 Анализ экспрессии целевого гена.
- •1.9.12 Выделение суммарного (общего) белка из клеток e. Сoli.
- •1.9.14 Фракционирование белков из клеток e. Сoli.
- •1.9.15 Денатурирующий белковый электрофорез в sds-пааг.
- •1.9.16 Отмывка телец включения
- •1.9.17 Растворение телец включения
- •1.9.18 Выделение SumoNgf при помощи металло-хелат-аффинной хроматографии
- •1.9.19 Рефолдинг белка
- •1.9.20 Расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2. Экспериментальные исследования
- •2.1 Получение векторных конструкций.
- •2.1.1 Сборка гена ngf методом пцр.
- •2.1.2 Получение векторной конструкции pTngf
- •2.1.3 Получение гибридной последовательности SumoNgf.
- •2.1.4 Получение векторной конструкции pTSumoNgf.
- •2.2 Биосинтез целевого и гибридного белка. Подбор условий культивирования.
- •2.2.1 Биосинтез белка ngf.
- •2.2.1 Биосинтез гибридного белка SumoNgf.
- •2.3 Выделение и очистка рекомбинантного фактора роста нервов человека.
- •2.3.1 Отмывка и растворение телец включения
- •2.3.2 Металло-хелатная аффинная хроматография
- •2.3.3 Масс-спектрометрия гибридного белка ngf
- •2.3.4 Рефолдинг гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Ферментативное расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Очистка ngf на катионобменной хроматографии.
- •2.3.5 Разработка обобщённой схемы производства рекомбинантного ngf
- •Организационно – экономический раздел
- •Технико-экономическое обоснование нир
- •2. Расчёт затрат на научно-исследовательскую работу
- •2.1. Расчет материальных затрат (Cм)
- •2.2. Энергетические затраты.
- •4.2.3. Расчет затрат на заработную плату.
- •2.4. Расчет затрат на стеклянную посуду, стеклянные приборы и пластик.
- •4.2.5. Амортизационные отчисления (Сам.).
- •2.6. Накладные расходы.
- •3 Выводы по разделу
- •Безопасность жизнедеятельности
- •1 Краткая характеристика выполняемой работы.
- •2 Опасные и вредные производственные факторы на основных стадиях выполнения дипломной работы.
- •3 Перечень наиболее опасных мест на стадиях выполнения дипломной работы.
- •Основные физико-химические, токсические и пожаровзрывоопасные свойства используемых в работе веществ.
- •5 Обеспечение безопасности труда в лаборатории.
- •6 Производственная санитария.
- •6.1 Установление категории лабораторного помещения.
- •6.2 Разработка мероприятий по работе с вредными веществами.
- •6.3 Метеорологические условия.
- •6.4 Вентиляция.
- •6.5 Освещение.
- •6.7 Отопление.
- •7 Техника безопасности.
- •7.1 Электробезопасность.
- •7.2 Пожарная профилактика.
- •8. Выводы по разделу.
3.6.3 Участие ngf в патологических состояниях.
Фактор роста нервов является белком, определяющим развитие симпатической нервной системы, благодаря стимуляции нервных клеток. Как было сказано выше, NGF отвечает за запуск множества метаболитических путей внутри клетки, тем самым обладая большим терапевтическим потенциалом для лечения болезней в которых задействованы эти реакции.
Впервые клиническое действие NGF, было изучено и испытанно при диабетической полинейропатии (ДПН), которая является одним из поздних осложнений сахарного диабета (CД), Она развивается в различные сроки практически у всех больных сахарным диабетом и приводит к серьезным расстройствам функционирования различных внутренних органов и систем, таких как сердечно-сосудистая, пищеварительная, мочевыводящая системы. ДПН также проявляется нарушениями потоотделения, аккомодации и адаптации зрачка, метаболическими изменениями. Патофизиологические механизмы, лежащие в основе развития ДПН, до сих пор полностью не изучены. Принято считать, что в патогенезе ДПН, большое значение имеют ишемия нервных волокон и метаболические изменения, происходящие в них под воздействием гипергликемии. При введении больным NGF происходит восстановление и значительное улучшение функционирования миелинизированных нервных волокон [].
В настоящее время изучается влияние NGF на зрительный нерв, который поражается при глаукоме. Актуальность данной темы велика, так как глаукома является тяжелым заболеванием глаз, которое выражается в повышении внутриглазного давления, дегенерации сетчатки и полной слепоте. Проведенные опыты показывают, что у животных, получавших длительное время фактор роста нервов, при крысиной модели глаукомы улучшается поле зрения, оптические функции нервов, контрастность, чувствительность и острота зрения. Такой положительный эффект достигается за счет образования комплекса NGF – TrkA в результате развивается нейропротекторное действие и происходит ингибирования апоптоза ганглиозных клеток сетчатки. Данные результаты указывают на перспективы терапевтического лечения глаукомы человека с помощью препаратов, содержащих NGF [].
Также стоить отметить, что фактор роста нервов может играть ключевую роль в восстановлении поврежденных нервных клеток у детей больных гидроцефалией, благодаря участию в регуляции выживания и дифференцировки нейронов []. При данном заболевании происходит избыточное накопление жидкости, содержащейся в полостях головного мозга и спинномозговом канале. Гидроцефалия бывает врожденной и приобретенной. Возникает при нарушении всасывания, избыточного образования жидкости в полостях головного мозга и затруднении ее оттока, например, при опухолях, спайках после воспалительного процесса. Состояние проявляется признаками повышения внутричерепного давления: головной болью (в первую очередь), тошнотой, рвотой, нарушением различных функций: слуха, зрения (последние 3 признака могут отсутствовать). Также отмечается задержка в физическом развитии ребенка — позже начинают держать голову, садиться, ходить, наблюдается слабость конечностей, преимущественно ног, острота зрения снижается, нередки эпилептические припадки, дети отстают в умственном развитии. Во время заболевания концентрация NGF в спинномозговой жидкости больных детей увеличивается, оказывая существенное влияние на патогенез гидроцефалии [].
Современные знания о структуре и функциях фактора роста нервов можно использовать в качестве фундамента для разработки методов борьбы с болезнью Альцгеймера (БА) – это дегенеративное заболевание головного мозга, проявляющееся прогрессирующим снижением интеллекта. Причем, с течением времени человек утрачивает способность обслуживать себя. Впервые болезнь описана немецким врачом А.Альцгеймером в 1907 году и, как на настоящее время стало ясно, является одной из наиболее распространенных форм приобретенного слабоумия (деменции). Только в США болезнью Альцгеймера, по данным 2007 года, страдают примерно 5 млн. человек и к 2050-му их число, по некоторым прогнозам, достигнет 13 млн. В американских домах престарелых 30% контингента составляют именно лица с БА. Хотя болезнь очень часто остается неопознанной, она занимает четвертое место среди причин смерти. В тех же США от нее, по оценочным данным, умирают более 100 тыс. человек в год. В патогенез БА вовлечено несколько различных механизмов, приводящих к утрате нервных клеток. Поскольку впервые БА была описана у лиц моложе 65 лет, ее ранее именовали «пресенильной деменцией». И ошибочно рассматривали как «проявление старения» или «склероз мозговых сосудов». На самом деле, как сейчас четко установлено, заболевание связано с дегенерацией нервных клеток (нейронов). БА примерно равномерно поражает все национальности и практически не зависит от социально-экономического статуса индивидуума. Со сложными болезнями, подобными БА, трудно бороться из-за того, что ни один из единичных подходов не адекватен. Исследуется сразу несколько нейропротективных подходов, и одним из перспективных в наше время является применение фактора роста нервов (NGF) – в норме присутствующего в организме белка, поддерживающего жизнеспособность нервных клеток головного мозга. В ряде исследований с инъекциями фактора роста нервов на ЦНС людей получены положительные результаты еще в 1980-е годы. С 1986 года доказан профилактический эффект инфузии NGF в головной мозг крыс в отношении гибели базальных холинергических нейронов переднего мозга на различных моделях (интоксикация, травмы и т.п.). С несомненным улучшением типичных когнитивных нарушений. Аналогичные дынные получены позже и для базальных отделов переднего мозга обезьян. Тем не менее, неспособность белка NGF пересечь гематоэнцефалический барьер, его короткий период полураспада и широкое влияние в пределах биологических сигналов делали невозможным их эффективное использование в клинических условиях. Кроме того, введение мышиного NGF пациентам с БА, боковым амиотрофическим склерозом и болезнью Паркинсона оказались неудачными из-за множества побочных эффектов. В ответ на эту дилемму были разработаны методики введения больным NGF-секретирующих клеток и в 2001 году начаты клинические испытания на человеке [] В настоящее время ученые большое количество времени уделяют направленному транспорту фактора роста нервов через гематоэнцефалический барьер в мозг с помощью нанотранспортных систем, а именно полимерных наночастиц [].
Анализ литературы показывает, что помимо различных заболеваний фактор роста нервов участвует в таком необычном состоянии человека, как влюбленность. Установлено, что, впервые месяцы любовных отношений уровень NGF в организме человека выше, чем в последующее время. Однако механизмы, лежащие в селективном увеличении NGF, еще не изучены, но предполагается, что увеличении концентрации фактора роста нервов происходит из-за эмоциональной зависимости или эйфории, а также стимуляции образования антидиуретического гормона (вазопрессина). Гормон гипоталамуса, который накапливается в задней доле гипофиза (в нейрогипофизе) и оттуда секретируется в кровь. Вазопрессин, а точнее его V(1A)-рецептор в мозге играет важную роль в социальном поведении, а именно в нахождении партнёра, в отцовском инстинкте у животных и отцовской любви у мужчин [].