- •Реферат
- •Введение
- •Обзор и анализ научно технической и патентной информации.
- •Нейтрофины.
- •Общая характеристика.
- •1.2 Нейротрофины в цнс
- •2. Рецепторы нейтрофинов.
- •2.1Высокоаффинный рецептор к нейротрофинам pl40 prototrk
- •2.2 Низкоаффинный рецептор к нейротрофинам p75lntr.
- •Фактор роста нервов.
- •История открытия
- •3.2 Молекулярная характеристика.
- •Третичная структура.
- •3.4 Механизм взаимодействия ngf с рецепторами.
- •3.5 Захват и ретроградный транспорт ngf.
- •3.6 Функции ngf в организме.
- •3.6.1 Действие ngf на нервные клетки.
- •3.6.2 Значение ngf в метаболизме.
- •3.6.3 Участие ngf в патологических состояниях.
- •4. Современные достижения в получении рекомбинантного ngf для фармацевтической индустрии.
- •5 Экспрессия рекомбинантных генов.
- •5.1 Вводная часть.
- •5.2 Конструирование экспрессионных векторов и их функционирование.
- •5.3 Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов.
- •6 Выводы по разделу
- •Основная часть
- •1. Материалы, методы и оборудование
- •1.1 Оборудование
- •1.2 Программное обеспечение
- •1.3 Лабораторные посуда и расходные материалы.
- •1.4 Штаммы e.Coli
- •1.5 Среды для выращивания бактерий
- •1.6 Препараты днк
- •1.7 Ферменты
- •1.7 Реактивы и наборы реактивов
- •Приготовление рвs буфера (х10):
- •10% Уксусная кислота
- •1.9.1 Рестрикция
- •1.9.2 Электрофоретичское разделение днк в агарозном геле.
- •1.9.3 Выделение днк из агарозного геля.
- •1.9.4. Полимеразная цепная реакция (пцр).
- •1.9.5 Лигирование.
- •1.9.6 Pipes трансформация клеток e. Coli плазмидной днк
- •1.9.7 Культивирование, выделение и очистка плазмидной днк из клеток e. Coli
- •1.9.8 Проведение пцр-скрининга.
- •1.9.9 Секвенированиеплазмидной днк.
- •1.9.10 Быстрая трансформация.
- •1.9.11 Анализ экспрессии целевого гена.
- •1.9.12 Выделение суммарного (общего) белка из клеток e. Сoli.
- •1.9.14 Фракционирование белков из клеток e. Сoli.
- •1.9.15 Денатурирующий белковый электрофорез в sds-пааг.
- •1.9.16 Отмывка телец включения
- •1.9.17 Растворение телец включения
- •1.9.18 Выделение SumoNgf при помощи металло-хелат-аффинной хроматографии
- •1.9.19 Рефолдинг белка
- •1.9.20 Расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2. Экспериментальные исследования
- •2.1 Получение векторных конструкций.
- •2.1.1 Сборка гена ngf методом пцр.
- •2.1.2 Получение векторной конструкции pTngf
- •2.1.3 Получение гибридной последовательности SumoNgf.
- •2.1.4 Получение векторной конструкции pTSumoNgf.
- •2.2 Биосинтез целевого и гибридного белка. Подбор условий культивирования.
- •2.2.1 Биосинтез белка ngf.
- •2.2.1 Биосинтез гибридного белка SumoNgf.
- •2.3 Выделение и очистка рекомбинантного фактора роста нервов человека.
- •2.3.1 Отмывка и растворение телец включения
- •2.3.2 Металло-хелатная аффинная хроматография
- •2.3.3 Масс-спектрометрия гибридного белка ngf
- •2.3.4 Рефолдинг гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Ферментативное расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Очистка ngf на катионобменной хроматографии.
- •2.3.5 Разработка обобщённой схемы производства рекомбинантного ngf
- •Организационно – экономический раздел
- •Технико-экономическое обоснование нир
- •2. Расчёт затрат на научно-исследовательскую работу
- •2.1. Расчет материальных затрат (Cм)
- •2.2. Энергетические затраты.
- •4.2.3. Расчет затрат на заработную плату.
- •2.4. Расчет затрат на стеклянную посуду, стеклянные приборы и пластик.
- •4.2.5. Амортизационные отчисления (Сам.).
- •2.6. Накладные расходы.
- •3 Выводы по разделу
- •Безопасность жизнедеятельности
- •1 Краткая характеристика выполняемой работы.
- •2 Опасные и вредные производственные факторы на основных стадиях выполнения дипломной работы.
- •3 Перечень наиболее опасных мест на стадиях выполнения дипломной работы.
- •Основные физико-химические, токсические и пожаровзрывоопасные свойства используемых в работе веществ.
- •5 Обеспечение безопасности труда в лаборатории.
- •6 Производственная санитария.
- •6.1 Установление категории лабораторного помещения.
- •6.2 Разработка мероприятий по работе с вредными веществами.
- •6.3 Метеорологические условия.
- •6.4 Вентиляция.
- •6.5 Освещение.
- •6.7 Отопление.
- •7 Техника безопасности.
- •7.1 Электробезопасность.
- •7.2 Пожарная профилактика.
- •8. Выводы по разделу.
1.9.12 Выделение суммарного (общего) белка из клеток e. Сoli.
Центрифугировали 100 мкл культуральной среды при 12.000 g в течение 10 мин. Осадок суспендировали в 100 мкл ТES-буфера. Нагреванием при 95°С в течение 5 мин лизировали клетки. Нерастворимые частицы осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 12.000 g. Отобрали супернатант и смешали в равном соотношении с краской для белкового электрофореза.
1.9.14 Фракционирование белков из клеток e. Сoli.
Биомассу, собранную с 0,5 мл культуры, размораживали и суспендировали в 50 мкл сферопластного буфера. К суспензии добавляли 5 мкл лизоцима (4 мг/ мл), приготовленного на сферопластном буфере, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут (периодически перемешивая). По окончании времени инкубации добавляли 450 мкл 0.1% Тритона Х-100, содержащего 0.1 мМ PMSF и 1 мМ ЭДТА, и инкубировали при комнатной температуре еще 5 минут. Образец обрабатывали ультразвуком на максимуме в течение 30 – 40 секунд, центрифугировали в течение 10 минут при 12000 g. Супернатант (это растворимый белок) отбирали в отдельную пробирку. Для получения раствора белка из телец включения осадок растворяли в 500 мкл TES-буфера.
1.9.15 Денатурирующий белковый электрофорез в sds-пааг.
Белковый электрофорез (ЭФ) проводили по методу Лэммли (Laemmli). Применяли 14 % разделяющий и 10 % формирующий гели,. Перед нанесением на гель образцы смешивали с буфером для нанесения. Электрофорез проводили при постоянном напряжении 200 В на приборе Mini–Protean II (“Bio–Rad”, США). После проведения электрофореза гель фиксировали и отмывали от SDS в растворе 10% уксусной кислоты в течение 30 минут. Затем гель окрашивали в растворе следующего состава: 10% уксусной кислоты, 0.1% Кумасси R–250 в течение 1 мин. Отмывку геля от краски проводили в растворе 10 % уксусной кислоты.
1.9.16 Отмывка телец включения
Замороженные клетки с 100 мл богатой среды 2 ZYM – 5052 суспендировали в 25 мл охлажденного лизис буфера ( 50 мМ Tris pH 8.0 и 0.1 % Triton). Суспензию обработали ультразвуком 5 раз по 30 сек. с охлаждением в перерывах 2 мин. Центрифугировали при 13400g, 40С, 10 минут. Для отмывки от тритона осадок суспендировали в 10 мл буфера (50 мМ Tris pH 8.0 и 100 мМ NaCI) и обработали ультразвкуом 5 раз по 30 секунд с охлаждением в перерывах 2 мин. Центрифугировали при 13400g, 40С, 10 минут. и повторили процедуру.
1.9.17 Растворение телец включения
Отмытые тельца включения растворяли в буферах, указанных в таблице _ , в течение 1 часа при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Нерастворимую часть отделяли при помощи центрифугирования при 13400g (40 С) в течение 20 минут. Осадок и супернатант анализировали при помощи денатурирующего ПААГ-электрофореза по Лэммли.
Таблица _ - Буфера для растворения телец включения.
№ |
Состав буфера |
1 |
50 мM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 M NaCI |
2 |
50 мM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 M NaCI, 0,5% Triton X-100 |
3 |
50 мM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 M NaCI, 5 М мочевины |
4 |
50 мM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 M NaCI, 3.5 М гуанидин гидрохлорида |